合成鋰皂土-海藻酸鈉復合屏障膜的制備及研究

程東東，周 璞，邢 新，鄒多宏,2

目前臨床上應用的可吸收引導骨再生 (guided bone regeneration，GBR) 膜通常受到機械強度弱、力學性能不足的限制，易發生穿孔和破裂。海藻酸鈉 (sodium alginate，SA) 是組織工程支架的常用材料，能促進實驗性骨缺損的骨再生，是GBR的合適材料。合成鋰皂土 (Laponite?, LAP) 除了作為粘土材料應用于傳統醫藥和化妝品，還可作為開發新的納米醫學功能材料，成為骨組織工程應用的理想選擇。有序的“磚-泥”微觀結構賦予了貝類優異的抗拉強度、剛度和韌性，受此啟發，引入無機納米填料制備類似特殊的層狀微結構，成為近十年來提高“軟基”聚合物力學性能的最常用方法。該研究采用噴涂組裝方法構建仿貝殼結構的二元體系LAP -SA復合膜，通過測試該復合膜的抗拉強度及其對NIH/3T3增殖的影響，探討其應用于組織工程屏障膜的可能性。

1 材料與方法

1.1 合成材料

SA[粘度(10 g/L,20 ℃)/(Pa·s)≥0.02,上海國藥集團化學試劑有限公司]；LAP(東莞市樟木頭鎮佳桐塑膠原料經營部)；無水氯化鈣(美國Sigma-Aldrich 公司)。

1.2 主要試劑和儀器

DMEM、胰酶消化液(美國Hyclone公司)；胎牛血清(美國Gbico 公司)；CCK-8試劑盒(日本株式會社同仁化學研究所)；力學萬能實驗機 (5565A，美國英斯特朗公司)；CO孵箱 (美國Thermo 公司)；掃描電鏡 (Supra40，德國蔡司公司)；透射電鏡 (HT7700，日本日立公司)；X 射線衍射儀 (X'Pert3 Powder，荷蘭帕納科公司)；傅里葉變換紅外光譜儀 (Nicolet 8700，美國熱電尼高力儀器公司)；酶標儀 (美國Bio-tek 公司)；高溫高壓滅菌鍋 (HVE-50，日本Hirayama 公司)。

1.3 原料配制

分別配制質量濃度為 2% 的SA溶液及LAP溶液。分別稱取 2 g 原料粉末溶于 98 ml 去離子水中，室溫下攪拌直至完全溶解分散。

1.4 復合薄膜的制備

首先制備LAP與SA的質量分數比為1 ∶10的復合膜(設為1組)，取 1 ml LAP 溶液與 10 ml SA溶液混勻，磁子攪拌 0.5 h 直至完全分散，真空箱內除氣泡后通過熱噴涂組裝方法，將混合液噴涂到熱的基材上，待水蒸發后干燥成膜。同理分別制備 LAP 與SA的質量分數比為3 ∶10、5 ∶10、7 ∶10、9 ∶10 的復合膜和純SA膜 (圖1)，分別命名為 3、5、7、9組和0組；隨后取抗拉強度最大的復合膜用 Ca螯合后作為Ca組，共6組。同時為后面材料表征，將抗拉強度最大的復合膜組直接設為復合膜組，將制備的純SA膜設為純SA膜組。

圖1 LAP-SA復合膜制備過程示意圖與展示圖

1.5 力學測試

在室溫下將每組薄膜裁剪為長 50 mm、寬 4 mm的測試樣品，并用螺旋測微儀測量每組樣品厚度，通過力學萬能實驗機以 0.1 mm/s的拉伸速度直至樣品斷裂，記錄其抗壓強度，每組樣品重復測試 6 次。取抗拉強度最大的復合膜組，重新制備測試樣品后浸泡于 0.5 mol/L的氯化鈣溶液中 5 s，室溫下自然干燥后，以同樣方法測試抗拉強度。最后繪制出相應的應力-應變曲線和斷裂應力值表。

1.6 樣品表征

取抗拉強度最大的復合膜組和純SA膜組，采用掃描電鏡觀察兩組膜截面的微觀結構。取 LAP 稀釋溶液滴在透射銅網表面，待干燥后采用透射電鏡觀察 LAP 納米片的形貌。取少量 LAP 納米片、SA膜和復合膜分別平鋪于觀測臺上，采用X射線衍射儀分析各組成分。研磨 LAP 納米片、復合膜及SA膜，采用傅立葉變換紅外光譜儀分析各成分。

1.7 細胞相容性實驗

取抗拉強度最大的復合膜組和純SA膜組，用0.5 mol/L的CaCl溶液預處理 5 s 后 PBS 洗凈。制備直徑為 6 mm 的圓形復合膜和純SA膜薄片，每組10個，高溫高壓滅菌。細胞系選用鼠胚胎成纖維細胞 (NIH/3T3細胞，由中國科學院細胞庫提供)，以8×10/孔接種，每組每個時間點5個復孔 (空白對照組僅接種NIH/3T3)，37 ℃、5%CO培養。24、48 h后將CCK-8試劑與DMEM按1 ∶9 比例混合，每孔加100 μl，37 ℃、5%CO培養 2 h。用酶標儀在 450 nm 處讀取吸光度值 (optical density, OD)。

2 結果

2.1 各組膜抗拉強度的比較

如圖2所示各組膜樣品的應力-應變曲線及斷裂應力值。隨著 LAP與SA質量分數比的增加，LAP-SA復合膜的抗拉強度也隨之增加，當 LAP與SA的質量分數比為5 ∶10時，即5組復合膜的抗拉強度達最大，之后繼續增加 LAP 含量，LAP-SA復合膜抗拉強度開始下降，各組總體差異有統計學意義 (

F

=77.385，

P

<0.001)。且5組膜樣品用 Ca螯合后，即Ca組的抗拉強度相比螯合前有一定增加且差異無統計學意義。

圖2 不同LAP-SA復合膜組和SA膜組樣品的抗拉強度比較A:各組樣品的應力-應變曲線；B:各組樣品的斷裂應力值；與0、1、3、7、9組比較： *P<0.05

2.2 樣品表征

LAP與SA的質量分數比為 5 ∶10 時，掃描電鏡下可見復合膜厚度約為 30 μm，截面呈明顯的有序層狀結構 (圖3)。透射電鏡示 LAP 納米片呈薄片狀，透光性和分散性良好(圖4)。X 射線衍射儀、傅里葉變換紅外光譜儀分析證實復合膜中存在LAP(圖5)。

圖3 掃描電鏡下觀察樣品截面的微觀結構×10 000A：純SA膜組的截面；B：復合膜組的截面

圖4 LAP納米片不同倍數下的透射電鏡觀察A:×10 000; B:×20 000; C:×50 000; D:×100 000

圖5 LAP-SA復合膜的組成成分分析A：復合膜的X射線衍射結果;B:復合膜的傅里葉變換紅外光譜結果

2.3 細胞相容性實驗結果

如圖6所示，選取LAP與SA質量分數比為5 ∶10復合膜作為復合膜組進行細胞相容性實驗,結果顯示NIH/3T3與空白對照組、純SA膜組和復合膜組共培養的24、48 h內，相同時間點各組OD值差異無統計學意義。

圖6 各組膜材料與NIH/3T3共培養不同時間后細胞計數的比較

3 討論

臨床常用的GBR膜可分為不可吸收性膜和生物可吸收性膜。然而，不可吸收性膜在創口愈合過程中存在軟組織開裂，導致屏障膜暴露的風險，可能造成創口感染甚至需要提前將其取出，從而影響GBR的再生效果；同時，在新骨形成之后必須實施第2次手術，將不可吸收性膜取出，從而不可避免地增加患者的痛苦和費用,并增加并發癥發生的概率。生物可吸收性膜主要由可降解的合成或天然聚合物組成，無需二次手術，并且很少發生軟組織開裂等并發癥，但屏障膜的機械強度不足會導致成骨效果不確定，如臨床上應用廣泛的Bio-Gide及其他可吸收膜的抗拉強度均低于100 MPa。

因此，本研究擬制備一種新型可代謝高機械性能GBR膜。藻酸鹽是一種天然存在的陰離子聚合物，其具有良好的生物相容性、低毒性，且成本相對低廉，以及通過添加二價陽離子(如Ca) 可發生凝膠化等特性，在生物醫學領域中被大量研究。然而，由于該類聚合物在生理條件下的不穩定性和較差的機械性能限制了其臨床應用。LAP是一種人工合成的可生物降解的層狀硅酸鹽，具有易于大量生產，廉價易得，純度、組成和晶體尺寸均可控等優勢，此外由于其納米材料的層狀結構，具有納米晶體組成的附加優勢，如較高的比表面積、吸附能力、表面反應性及陽離子的交換能力，因此能夠作為具有流變特性的改性劑和成膜劑在技術層面廣泛應用。其可通過帶負電荷表面和帶正電荷邊緣與生物大分子發生多種物理結合，已有多個研究表明，向聚合物網絡中引入LAP納米顆粒可以大大提高復合物的機械性能。同時，近年來的研究表明，LAP可以釋放Mg等離子，是一種極具潛力的骨修復材料，可以改善細胞黏附，誘導骨髓間充質干細胞成骨分化。Wang et al研究了LAP生物陶瓷在骨組織工程應用中潛在的適用性，其結論顯示LAP生物陶瓷具有良好的生物安全性以及表面親水性和蛋白質吸附活性，同時體內骨愈合效果良好，在骨組織工程中具有廣闊的應用前景。

因此，本課題組擬向SA體系中加入LAP作為物理交聯劑以及硅酸鹽填料來提高復合膜的機械性能和成骨誘導功能。為使納米晶體在體系中分散均勻，本課題組將混有LAP的SA懸浮溶液噴涂到熱的基材上，待水蒸發后便可形成有序的層狀微結構。完成復合膜制備后便進行力學抗拉強度測試，當LAP與SA的質量分數比為5 ∶10時，復合膜的抗拉強度達到最大 (166.9±11.5) MPa。為了進一步提高復合膜的機械性能，本課題組采用氯化鈣浸泡的方法，使Ca與 SA 產生螯合作用從而穩固復合膜，并測試其抗拉強度。結果顯示 Ca螯合后的抗拉強度可增加至 (178.0±14.8) MPa，相比螯合前有一定增加，但差異無統計學意義。