ferrostatin-1保護對乙酰氨基酚誘導的小鼠急性肝損傷

蔣慰贏，秦明強，張 程，屈明超，徐德祥，王建青

對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)是臨床上常用的解熱鎮痛藥物，應用非常廣泛，在治療劑量下APAP不會引起急性肝損傷(acute liver injury，ALI)，然而APAP一旦過量就會導致急性肝損傷甚至是急性肝功能衰竭。據統計，在美國每年APAP中毒的急診患者約56 000例，其中約450例死亡。

鐵死亡(ferroptosis)是近年來發現的一種細胞死亡方式，其具有與其他細胞死亡不同的形態和生化特征。研究表明，在體外條件下，鐵死亡抑制劑ferrostatin-1(fer-1)對APAP誘導的小鼠肝細胞的死亡有保護作用，但其具體機制并不明確。該研究探討fer-1保護APAP誘導的小鼠ALI的機制，為臨床預防和治療APAP過量導致的ALI提供新的方向和思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用88只SPF級雄性ICR小鼠， 8周齡，體質量為36～42 g，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司。小鼠飼養在適宜的環境中，具體環境如下：溫度保持在(25±1)℃，濕度保持在(55±5)%，保持12 h/12 h晝夜交替，可自由飲水攝食。本研究所使用的動物實驗均已通過安徽醫科大學動物倫理委員會審查并批準(許可證編號：20131179)。

1.2 試劑

fer-1購自美國MCE公司；APAP、NAC購自美國Sigma公司；聚氧乙烯蓖麻油EL(CremophorEL)購自上海阿拉丁生化有限公司；天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酶氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)檢測試劑盒購自浙江伊利康生物技術有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；RT-PCR相關試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司以及美國Promega公司；研究中引物均由實驗室設計并交給上海Invitrogen有限公司合成。

1

.

3 方法

1

.

3

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1

生存實驗 將40只雄性ICR小鼠隨機分為4組(

n

=10)，APAP模型組：對小鼠進行單次APAP腹腔注射，劑量為500 mg/kg；fer-1預處理組：在APAP注射前1 h提前腹腔注射fer-1(5 mg/kg)；fer-1后處理組：在APAP注射后1 h腹腔注射fer-1(5 mg/kg)；NAC后處理組：在APAP注射后1 h腹腔注射N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)(300 mg/kg)。在處理完后，觀察并記錄7 d內小鼠的死亡情況。小鼠的存活率以生存小鼠數目/原有小鼠數目×100%計算所得，并以生存率作圖。

1

.

3

.

2

時效實驗 小鼠隨機分為以下幾組(

n

=6)： 0 h組、fer-1組、APAP模型組(1、4、24 h)、fer-1預處理組(1、4、24 h)。fer-1預處理組在小鼠腹腔注射400 mg/kg APAP的前1 h腹腔注射5 mg/kg的fer-1，隨后在注射APAP的0、1、4、24 h對小鼠進行取材。

1

.

3

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3

血清生化指標檢測 實驗動物血清中肝功能指標通過貝克曼全自動生化檢測儀檢測，檢測指標為ALT和AST。

1

.

3

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4

肝臟MDA含量測定 精密稱取100 mg小鼠肝臟組織，放入1 ml預先4 ℃冷藏的0.9%氯化鈉溶液中，隨后批量放入自動勻漿儀中進行勻漿，制備濃度為20%的勻漿液。制備好的組織勻漿液在 3 500 r/min、4 ℃下離心15 min，取上清液備用。提前配置好所需試劑，根據試劑盒中提供的說明書進行相關操作，使用酶標儀用532 nm波長檢測上清液的吸光度，并采用BCA法檢測上清液中的總蛋白濃度后，根據公式[(測定管吸光度-空白管吸光度)/(標準管吸光度-空白管吸光度)×標準管濃度/待測蛋白濃度]計算結果后分析。

1

.

3

.

5

組織病理學檢測 取小鼠肝大葉，4%多聚甲醛固定后，進行包埋、切片、HE染色、封固、透明、脫水、封片、光鏡下觀察。選取各組切片中連續的3個視野下的圖像照片(×100)，采用ImageJ軟件對圖像進行分析并定量。

1

.

3

.

6

肝臟組織基因檢測

1

.

3

.

6

.

1

肝臟RNA的提取和逆轉錄 采用TRIzol法提取小鼠肝臟總RNA后，使用酶標儀進行RNA樣品定量分析，測定樣品在260、280 nm波長處的吸光度值(OD)并計算OD260/OD280比值，加入無酶水將所有RNA樣品的終濃度定量在500 ng/μl。依據逆轉錄試劑盒中所提供的說明書，使用逆轉錄儀將RNA逆轉錄成cDNA。

1

.

3

.

6

.

2

RT

-

PCR擴增反應 設計好的引物用無酶水稀釋后，與逆轉錄的cDNA、PCR Mix、無酶水配置成20 μl的擴增反應體系。把擴增體系加入到96孔板后，將擴增板放入離心機中離心，放入Light Cycler480 PCR儀，選擇預定程序進行擴增。選取18S作為內參基因，計算長鏈脂酰輔酶A合成酶4(long-chain acyl-coa synthetase，

ACSL

4)和前列腺素內過氧化物酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase，

ptgs

2)、轉鐵蛋白受體 1(transferrin receptor 1，

TFR

1)、鐵調素調節蛋白(hemojuvelin，

HJV

)、轉鐵蛋白受體 2(transferrin receptor 2，

TFR

2)、鐵調節蛋白1(iron regulatory protein，

IRP

1)和18S核糖體RNA(18S ribosomal RNA，18

S

)基因的相對表達水平。引物序列如表1所示。

表1 基因的引物序列

2 結果

2.1 fer-1處理對APAP誘導的ALI小鼠的生存率的影響

生存實驗結果如圖1所示，APAP處理后僅10%的小鼠在第7天處于存活狀態。NAC處理后的小鼠存活率提高到70%，而fer-1預處理和后處理與NAC后處理相比，小鼠的存活率進一步提高到90%和80%。采用Kaplan-Meier法分析數據，fer-1預處理和后處理與NAC后處理組相比，生存率都得到了提升(

P

<0.05，

F

=19.32)，表明fer-1與NAC相比，可能治療效果更佳。

圖1 fer-1處理對APAP誘導的急性肝損傷小鼠生存率的影響

2.2 fer-1預處理對APAP誘導的ALI小鼠肝重系數的影響

結果如圖2所示，與APAP(0 h)組相比，單純注射fer-1對小鼠的肝重系數差異無統計學意義；與APAP(0 h)組相比，單純APAP處理的各組中給予APAP 4、24 h后，小鼠的肝重系數均有所升高(

P

<0.05，

F

=3.222)；與單純APAP處理各組相比，fer-1預處理在4 h時小鼠肝臟系數降低(

P

<0.05，

t

=2.466)，24 h時小鼠肝臟系數也降低(

P

<0.05，

t

=3.272)。

圖2 各組小鼠肝重系數與APAP(0 h)組比較：*P<0.05；與APAP(4 h)組比較：#P<0.05；與APAP(24 h)組比較：&P<0.05

2.3 fer-1預處理對APAP誘導的ALI小鼠肝細胞壞死情況的影響

結果如圖3所示，與APAP(0 h)組相比，單純注射fer-1對小鼠肝臟組織沒有明顯的毒副作用；與APAP(0 h)組相比，單純APAP處理的1、4、24 h組隨著APAP注射時間的增加，小鼠肝臟組織中的炎癥浸潤區域和組織壞死面積也增加(

P

<0.01，

F

=254.9)；與單純APAP組相比，fer-1預處理對APAP造成的小鼠肝臟組織的炎性浸潤和組織壞死有一定的改善作用，APAP處理24 h時炎癥浸潤區域和組織壞死面積下降，治療效果明顯(

P

<0.01，

t

=11.12)。

圖3 各組小鼠肝臟組織H&E染色以及組織壞死面積 ×100與APAP(0 h)組比較：**P<0.01；與APAP(1 h)組比較：##P<0.01；與APAP(4 h)組比較：&&P<0.01；與APAP(24 h)組比較：$$P<0.01

2.4 fer-1預處理對APAP誘導的ALI小鼠肝功能的影響

檢測結果如表2所示，fer-1對小鼠的肝功能并沒有影響；與APAP(0 h)組相比，給予了APAP的各組小鼠各項肝功能指標均發生了較為明顯的改變，各時間點小鼠血清中的ALT、AST隨之增加，在24 h達到最高遠超正常水平且差異有統計學意義(

P

<0.01，

F

= 144)，與單純APAP處理組相比，使用fer-1預處理組小鼠的血清ALT和AST在各個時間點均有所降低，在24 h時下降水水平最明顯，接近正常水平，治療效果明顯(

P

<0.01，

t

=13.11)。

表2 各組小鼠血清中ALT、AST水平

2.5 fer-1預處理對APAP誘導的ALI小鼠肝臟

中MDA水平的影響

結果如圖4所示，與APAP(0 h)組相比，單獨給予fer-1并不影響小鼠肝臟組織中MDA的水平；與APAP(0 h)組相比，單純給予APAP后1、4 h時，小鼠肝臟MDA水平有所上升(

P

<0.05，

F

=5.87)，到24 h時恢復至正常水平；與同一時點的單純APAP組相比，fer-1預處理1、4 h時，小鼠肝臟MDA水平降低，1 h時最明顯(

P

<0.05，

t

=2.683)，到24 h時基本恢復至正常水平。

圖4 各組小鼠肝臟組織MDA水平與APAP(0 h)組比較：*P<0.05；與APAP(1 h)組比較：#P<0.05；與APAP(4 h)組比較：&P<0.05

2.6 fer-1預處理可降低APAP誘導的ALI小鼠鐵死亡相關基因的表達

采用RT-PCR實驗檢測fer-1預處理后各組小鼠鐵死亡相關基因

ACSL

4和

ptgs

2的表達變化。如圖5所示，與APAP(0 h)組相比，單純APAP處理組給予APAP 4、24 h后，鐵死亡標志基因

ACSL

4和

ptgs

2在小鼠肝臟組織中的表達水平升高(

P

<0.05，

F

=8.133)；與單純APAP處理組相比，fer-1預處理在4、24 h組小鼠肝臟組織中的

ACSL

4和

ptgs

2的表達降低，4 h時有統計學意義(

P

<0.05，

t

=4.098)，提示fer-1預處理可以降低APAP誘導的小鼠肝臟組織中鐵死亡相關基因ACSL4和ptgs2的高表達。

圖5 各組小鼠肝臟組織鐵死亡相關基因的表達與APAP(0 h)組比較：*P<0.05；與APAP(4 h)組比較：#P<0.05；與APAP(24 h)組比較：&P<0.05

2.7 fer-1預處理可改善APAP誘導的ALI小鼠鐵代謝紊亂

采用RT-PCR實驗檢測fer-1預處理4、24 h后各組小鼠肝臟中鐵代謝相關基因轉鐵蛋白受體 1(

TFR

1)、鐵調素調節蛋白(

HJV

)、轉鐵蛋白受體 2(

TFR

2)和鐵調節蛋白1(

IRP

1)的表達變化。如圖6所示，與APAP(0 h)組相比，單純給予fer-1對小鼠肝臟組織中

TFR

1、

HJV

、

TFR

2和

IRP

1的表達差異無統計學意義；與APAP(0 h)組相比，單純APAP處理組給予APAP 4、24 h后，小鼠肝臟組織中的

TFR

1、

HJV

、

TFR

2和

IRP

1的表達異常，差異有統計學意義(

P

<0.05)，與同一時點的單純APAP組相比，fer-1預處理在4、24 h組改善了小鼠肝臟組織中

TFR

1、

HJV

、

TFR

2和

IRP

1的表達異常，差異有統計學意義(

P

<0.05)，提示fer-1預處理可以改善APAP誘導的ALI小鼠肝臟組織中鐵代謝紊亂。

圖6 各組小鼠肝臟組織鐵代謝相關基因的表達與APAP(0 h)組比較：*P<0.05；與APAP(4 h)組比較：#P<0.05；與APAP(24 h)組比較：&P<0.05

3 討論

APAP過量誘導的肝毒性的具體機制目前尚不完全清楚，其主要涉及氧化應激和炎癥反應，從而引起各種形式的肝細胞死亡。因此，確定細胞死亡的可能機制對于臨床上治療APAP過量引起的ALI乃至肝衰竭有著重要意義。

本實驗首先采用陽性對照藥NAC與fer-1分別處理APAP誘導的ALI小鼠，觀察fer-1預處理和后處理對小鼠生存率的影響，并且與NAC作比較，結果顯示與NAC預處理相比，fer-1無論是預處理還是后處理，均能提高小鼠的生存率。病理觀察、肝臟系數和ALT、AST結果均表明，fer-1預處理可以減輕APAP誘導的ALI。

鐵死亡抑制劑在鐵死亡中的作用主要是改善鐵代謝和降低細胞內的脂質過氧化水平。先前的研究表明

ACSL

4和

ptgs

2是標志鐵死亡發生的重要標志物。該實驗結果顯示APAP各組中的

ACSL

4和

ptgs

2表達上升，而使用fer-1預處理后，升高的

ACSL

4和

ptgs

2水平降低。這些結果提示鐵死亡在APAP誘導的急性肝損傷中可能確實發揮著部分作用，并且鐵死亡抑制劑fer-1預處理具有一定的保護作用。肝臟鐵過載引起細胞內鐵水平的增加，這增強了APAP過量誘導的急性肝損傷作用，也加劇了氧化應激反應。鐵調素是肝臟內分泌的調節鐵穩態的蛋白，報道表明，HJV和TFR2是鐵調素表達的重要調節因子。而TFR2在肝中表達時可以與HJV相互作用，發揮誘導鐵調素轉錄的作用。該研究結果顯示，在小鼠接受APAP處理后，

HJV

和

TFR

2的 mRNA水平均有不同程度的降低，這可能與 APAP誘導的氧化應激有關。研究表明，細胞內鐵穩態的關鍵介質是鐵調節蛋白/鐵反應元件(IRP / IRE)系統，該系統包括 IRP1/IRP2和儲存鐵蛋白等。該研究表明，APAP過量處理后小鼠肝臟IRP1的轉錄水平降低。當細胞內鐵過多時，IRP1與 IRE 的結合活性就會降低，從而引起鐵蛋白 mRNA 的翻譯，促使過多的細胞內鐵進行儲存。這些結果提示，過量服用 APAP的確對肝臟鐵穩態有一定影響。

綜上所述，該研究表明新型細胞死亡方式鐵死亡與APAP誘導的小鼠ALI的發生發展有關。此外，鐵死亡抑制劑fer-1可以防治 APAP過量引起的ALI。fer-1 對 APAP誘導的ALI的保護作用一方面可能由于其特定的自由基清除能力，同時還可能與其對肝臟鐵代謝功能障礙的改善有關。因此，鐵死亡抑制劑可能是APAP過量引起小鼠ALI的有效解毒劑，并且可能在未來應用于APAP過量引起的ALI的臨床治療。