產丙酮酸棒狀桿菌肽聚糖的提取和抗血流感染作用的研究

章 楊，周 強，陳禮文，劉 周,韓清珍，史進方

產丙酮酸棒狀桿菌(

Corynebacterium

pyruviciproducens

，CP)由Tong et al在1例腹股溝膿腫中發現的一種革蘭陽性棒狀桿菌。另有研究表明CP與傳統的免疫佐劑痤瘡丙酸桿菌(

Propionibacterium

acnes

)相比，CP的免疫調節能力更強。肽聚糖(peptidoglycan，PGN)是細菌細胞壁的特有組成成分，可以刺激免疫細胞，發揮各種免疫調節作用，發揮該作用的機制與途徑取決于細胞壁中PGN的含量與結構。耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant

Staphylococcus

aureus

，MRSA)是醫院血流感染的主要致病菌。通過前期實驗證實，產丙酮酸棒狀桿菌肽聚糖(CP-PGN)對MRSA血流感染具有明顯的防治效果。為研究CP-PGN對革蘭陰性菌及真菌是否有同樣的抗血流感染作用，該研究選取了醫院感染中具有代表性的革蘭陰性桿菌-多重耐藥的肺炎克雷伯菌(

Klebsiella

pneumoniae

，KPN)及真菌-白色念珠菌(

Candida

albicans

，CAL)，建立小鼠血流感染模型，探討CP-PGN對不同病原菌的抗血流感染能力，為將細菌性免疫調節劑作為臨床血流感染的一種輔助治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗菌及實驗動物

產丙酮酸棒狀桿菌由美國加州大學洛杉磯分校 Olive View 醫學中心提供；產丙酮酸棒狀桿菌肽聚糖由蘇州大學附屬第一醫院中心實驗室提取并保存；多重耐藥的KPN、CAL均為蘇州大學附屬第一醫院臨床分離株；BABL/c 小鼠6～8周齡，體質量(25±2)g，雌性，15～18只，購自揚州大學實驗中心，按照動物房的標準條件進行飼養。

1.2 主要試劑與儀器

溶菌酶購自美國Amresco公司。酶標儀購自美國BioTek公司；超聲破碎儀購自美國SONICS公司；S433D型氨基酸分析儀購自德國SYKAM公司。

1.3 方法

1

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3

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1

CP菌體的制備 將凍存的CP菌株進行活化培養，無菌挑取一定量的菌落接種于含5%植物油的LB培養基中，37 ℃恒溫振蕩箱中振蕩培養48 h后將培養液離心，收集菌體，最后用無菌生理鹽水多次洗滌離心直至菌體沉淀為乳白色，靜置，待水分自然蒸發后對其稱重。

1

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3

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2

CP

-

PGN的提取 采用三氯乙酸法(TCA法)提取PGN。取洗滌離心得到的80 g CP菌體，提取步驟主要包括磷壁酸的去除、蛋白的去除、脂類物質的去除，再用無水乙醇脫水并稱重(干燥前)，置于70 ℃恒溫烘箱中徹底烘干，最終得到褐色膠狀物(干燥后)。根據下列公式計算肽聚糖提取率：

肽聚糖提取率(%)=干燥前肽聚糖重量/收集的菌體重量×100%

1

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3

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3

CP

-

PGN的純度驗證 采用溶菌酶溶解試驗，用0.1 mol/L pH6.2的PBS將溶菌酶配成200 μg/ml的溶液。將一定量的CP-PGN加入該溶液中配制成5 mg/ml 的終溶液，立即用BioTek酶標儀在450 nm處讀取第1個吸光度值，然后于37 ℃恒溫搖床中140 r/min振蕩反應，每小時讀取1個吸光度值并記錄。

1

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3

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4

CP

-

PGN的結構分析 將提取的CP-PGN送至科譜研發技術中心(青島)有限公司，對其分子量、結構(傅里葉紅外光譜分析)進行分析。

1

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3

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5

CP

-

PGN的氨基酸組成 將一定量的提取物與6 mol/L的鹽酸溶液在110 ℃的真空條件下作用20 h，經氨基酸分析儀檢測該肽聚糖的氨基酸組成。

1

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3

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6

CP和CP

-

PGN的抗感染動物模型構建

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3

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6

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1

熱滅活的CP及CP-PGN溶液的制備 收集培養48 h后的CP菌液，離心去上清液。再用滅菌PBS離心洗滌沉淀2遍，去上清液。將該沉淀加入滅菌PBS充分混勻，置于62 ℃水浴滅活3 h后，通過將溶液接種于血瓊脂平板培養檢測是否完全滅活。剩余的CP菌液分裝保存備用。將一定量的固體狀CP-PGN溶解于滅菌PBS中，通過超聲破碎儀進行破碎溶解，配制成相應濃度的溶液供后續實驗使用。

1

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3

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6

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2

感染病原菌的制備 將臨床分離的KPN和CAL接種于LB培養液中，培養24 h后的細菌培養液用滅菌PBS進行10、10、10一系列倍數稀釋，具體操作方法為：分別吸取1 μl KPN/CAL培養液加入到含有999 μl滅菌PBS的滅菌EP管中進行10稀釋；將該稀釋液按照同樣的方法再次進行10稀釋，配制成稀釋10的稀釋菌液；最后將稀釋10的稀釋菌液分別進行10、100、1 000倍稀釋后，將100 μl的該稀釋菌液置于血平板中，用一次性L型無菌涂布棒采用平板涂布法使其均勻分布整個血平板，于37 ℃培養箱中培養24 h后計數平板中的菌落數，根據稀釋倍數將菌液稀釋成最終注射濃度。

1

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3

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6

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3

動物感染模型的構建 構建KPN/CAL血流感染的動物模型。6～8周的BALB/c小鼠隨機分成對照組(Control組)、產丙酮酸棒狀桿菌組(CP組)和產丙酮酸棒狀桿菌肽聚糖組(CP-PGN組)，每組5～6只。參考相關文獻對小鼠CP/CP-PGN的最佳注射濃度進行多次摸索，注射一定濃度的CP/CP-PGN后，主要根據小鼠的精神狀態、活躍程度、呼吸頻率等指標確定最佳注射劑量。經小鼠尾靜脈分別注射滅菌PBS、CP(500 μg/只)、CP-PGN(100 μg/只)。24 h后3組小鼠同時尾靜脈注射KPN(10×10/只)/CAL(1×10/只)菌液。觀察小鼠的精神狀態、活動情況，記錄小鼠的生存時間。獲取3組小鼠的脾臟組織，對其重量和體積(長×寬×高)進行測量和分析。

2 結果

2.1 CP-PGN提取率的計算

本次實驗共收集了80 g CP菌體，最終提取的肽聚糖量為0.241 4 g，則該肽聚糖提取率為0.3%。

2.2 溶菌酶溶解實驗

CP-PGN與溶菌酶溶液作用后的吸光度值變化如圖1所示，在最開始的2 h內吸光度值大幅度的降低，2 h之后吸光度值趨于穩定。表明提取物可以被溶菌酶降解，證實為肽聚糖。

圖1 肽聚糖的溶菌酶溶解實驗

2.3 CP-PGN的結構分析

圖2顯示CP-PGN的分子量為18 774 u。圖3的傅里葉紅外光譜分析顯示，提取的CP-PGN在3 500～3 200 cm、3 000～2 800 cm、1 400～1 200 cm處存在多糖類物質的特征吸收峰；1 650 cm處是酰胺特征吸收峰；862 cm處是β-吡喃糖苷件吸收峰；1 560～1 540 cm處為N-H變角振動峰；1 055 cm處有C-O振動吸收峰和O-H變角振動峰2個峰。

圖2 肽聚糖分子量分析結果

圖3 肽聚糖傅里葉紅外光譜分析

2.4 CP-PGN的氨基酸組成及含量

CP-PGN的氨基酸組成及其含量見表1所示，結果表明CP-PGN的氨基酸組成中，含量較多的依次為谷氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸。

表1 肽聚糖的氨基酸組成及其含量[n(%)]

2.5 CP-PGN能增強小鼠抗KPN/CAL引起的血

流感染的能力

在小鼠感染KPN/CAL之前，提前注射CP/CP-PGN，可顯著增強小鼠的抵抗力。CP和CP-PGN兩組的小鼠精神狀態、活動度等均高于Control組小鼠，CP-PGN組作用更明顯。繪制的生存曲線顯示， CP-PGN能有效延長KPN/CAL感染組小鼠的生存時間，提高存活率，差異有統計學意義(

P

<0.05)，如圖4所示。脾臟是機體的一種重要免疫器官，它的重量和大小能夠間接反映機體的免疫功能。感染KPN后，CP組小鼠的脾臟體積和重量明顯大于Control組(

t

=4.824，

P

=0.008；

t

=5.266，

P

=0.004)；而在CAL感染后，CP-PGN組小鼠的脾臟體積和重量明顯大于Control組，差異有統計學意義(

t

=5.639，

P

=0.008；

t

=3.560，

P

=0.02)，說明在感染KPN/CAL之前注射CP或CP-PGN，對小鼠的免疫能力產生不同程度的影響，如圖5、6所示。

圖4 KPN/CAL血流感染模型的小鼠生存曲線與Control組比較：*P<0.05；CP：C. pyruviciproducens；CP-PGN：PGN of C. pyruviciproducens

圖5 KPN血流感染模型小鼠的脾臟指標與Control組比較：**P<0.01；CP：C. pyruviciproducens；CP-PGN：PGN of C. pyruviciproducens

圖6 CAL血流感染模型小鼠的脾臟指標(體積與重量)與Control組比較：*P<0.05，**P<0.01；CP：C. pyruviciproducens；CP-PGN：PGN of C. pyruviciproducens

3 討論

肽聚糖作為細菌細胞壁的主要成分，提取方法多樣。本研究選用了用時短、操作簡便的三氯乙酸法進行CP-PGN的提取。本次研究中CP-PGN的提取率為0.3%。提取后的終產物經過相關驗證、分析與檢測，表明提取的褐色膠狀物主要成分即為肽聚糖。不同種類的細菌，其細胞壁的厚度及肽聚糖的含量也存在差別，因此用同種方法進行肽聚糖的提取也會造成提取率的不同，這也是本研究中CP-PGN提取率稍低的一個重要原因。為了提高提取效率，更好地保持其結構的完整性，CP-PGN的提取方法還有待進一步的摸索與優化。此外，不同種類的細菌肽聚糖，發揮的免疫調節作用因肽聚糖的結構與含量不同而存在差異。因此本研究有關CP-PGN的分子量、結構、氨基酸等方面的分析，為后續的抗血流感染作用的研究提供理論支持。

血流感染是一種嚴重的全身性感染疾病，是病原菌在血液循環中短暫或者持續性的存在，能夠引起患者多器官衰竭，甚至死亡，對患者的生命健康造成威脅。引起醫院血流感染的病原菌可分為革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和真菌三大類。肺炎克雷伯菌是重要的腸桿菌科細菌，引起的醫院內感染越來越廣泛，發生率僅次于凝固酶陰性葡萄球菌，位居醫院血流感染的革蘭陰性菌第二位。由于廣譜抗生素的過度使用及更新換代，肺炎克雷伯菌的耐藥性問題也越來越嚴重，從而加大了臨床的治療難度。念珠菌是院內血流感染位居第四的病原菌，其發病率和致死率不斷升高。引起念珠菌血流感染的念珠菌種類多，最常見的念珠菌為白色念珠菌。近年來，真菌的耐藥性也在逐漸的加重，從而導致該菌血流感染發病率的增加。在全球抗生素危機情況下，需要尋找新的預防感染及治療方法來應對挑戰，而免疫調節劑可以調動機體的免疫系統，增強免疫力，因此聯合或者代替抗生素應用，為血流感染的預防與治療提供一種新型的治療方案，從而減輕抗生素的使用量。

本研究顯示，在感染KPN/CAL之前，預先注射CP-PGN，與未注射CP/CP-PGN的對照組相比，小鼠的精神及活動狀態均有所改善，明顯延長了小鼠的生存時間，提高了生存率，免疫器官-脾臟在體積和重量上都有不同程度的增加，免疫能力有所增強，表明CP-PGN對KPN和CAL引起的血流感染具有一定的預防作用，可作為一種有潛力的新的免疫調節劑，為預防和治療血流感染提供輔助治療。在面臨抗生素危機的情況下，將抗生素和合適的免疫調節劑組合治療也是一種新的治療方法，從而減少對抗生素的過度依賴，一定程度上緩解全球抗生素危機。以上有關CP-PGN抗KPN/CAL血流感染的相關研究數據，聯合前期抗MRSA感染作用的數據證實，CP-PGN在血流感染的防治上發揮著重要作用，而CP-PGN在對抗MRSA/KPN/CAL三種病原菌的感染中發揮著不同程度的防治效果，造成效果差異的具體機制還有待后續進一步研究，為CP-PGN作為免疫增強劑在臨床上的應用提供基礎理論支持。