HDAC3負性調控mTOR促進低氧誘導H9C2心肌細胞自噬

王月涵，黃 穎

細胞自噬是指在生理或病理條件下，溶酶體降解自身的細胞器或者分子物質的過程。心肌細胞自噬能夠促進心室重構，是導致心力衰竭的重要原因之一。但迄今為止，導致心肌細胞自噬的機制尚不明確。組蛋白去乙?；? (histone deacetylase 3, HDAC3)是表觀遺傳學調控的重要分子。研究表明HDAC3能夠促進心肌細胞肥厚，誘導心功能不全，并和先天性心臟病有著密切關系。因此，該研究探討HDAC3調控低氧誘導H9C2心肌細胞自噬的功能和分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

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細胞株 本實驗所用大鼠H9C2心肌細胞株購自中國科學院上海細胞庫。

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主要試劑 兔抗LC3B單克隆抗體、兔抗P62單克隆抗體、兔抗Beclin-1單克隆抗體、兔抗HDAC3單克隆抗體、兔抗mTOR單克隆抗體、兔抗GAPDH單克隆抗體均購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔抗體購自北京中杉金橋生物技術公司；細胞培養試劑購自美國Gibco公司。HDAC3引物序列F：5′-GATGACCAGAGTTACAAGCACC-3′；R：5′-TTGAAGCAGCCTAATCGATCAC-3′；siRNA引物序列:5′-CTGCATTATGGTCTCTATATT-3′。

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實驗儀器 細胞培養箱購自美國Thermo公司；低氧小室購自加拿大Stem Cell公司；蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司；GE Amersham Imager 600自動化學發光凝膠成像分析系統購自美國GE公司。

1.2 方法

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心肌細胞低氧實驗 大鼠H9C2心肌細胞用DMEM+10%FBS培養基培養，將H9C2細胞分為4組，對照組進行常氧培養，低氧組分為3組，分別是低氧1 h(1 h組)、低氧6 h(6 h組)、低氧12 h(12 h組)，然后將4組細胞放入正常恒溫孵箱中培養。

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免疫熒光檢測 爬滿細胞的玻片以多聚甲醛固定清洗后，加入0.1% Triton X-100室溫處理，然后加入牛血清白蛋白(albumin from bovine serum, BSA)，室溫下封閉細胞1 h。孵育一抗，放入濕盒4 ℃冰箱過夜。避光條件下孵二抗1 h。DAPI染色10 min，用細胞儀檢測細胞自噬的變化。

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Western blot 檢測蛋白表達水平 收集心肌細胞裂解液，上樣前先將樣品置于沸水5 min變性，然后進行SDS-PAGE電泳并轉膜至硝酸纖維素膜上。脫脂奶粉封閉1 h后，分別加入適當稀釋比的一抗室溫下孵育12 h，洗膜后加二抗室溫孵育2 h。經化學發光法曝光后觀察結果，檢測自噬相關蛋白LC3B-Ⅱ、Beclin-1和P62的表達變化，實驗中以GAPDH為內參照。

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細胞轉染實驗 H9C2心肌細胞分組后，先后加入Opti-MEM和Lipofectamine 3000處理，分別轉染HDAC3過表達質粒和siRNA 8 h。此時，將H9C2心肌細胞分為5組，分別為對照組(H9C2組)、siRNA空載質粒組(H9C2+siRNA NC組)、HDAC3敲減組(H9C2+siRNA組)、過表達空載質粒組(H9C2+OE NC組)、HDAC3過表達組(H9C2+OE組)。再次更換培養基，置于37 ℃、CO培養箱中培養48 h。

2 結果

2.1 低氧誘導H9C2心肌細胞自噬

為了驗證低氧誘導H9C2心肌細胞的自噬，分別檢測自噬相關蛋白LC3B-Ⅱ、Beclin-1和P62的表達變化。與對照組比較，在低氧后1 h，H9C2心肌細胞中LC3B-Ⅱ、Beclin-1和P62蛋白表達均增加(

P

<0.05)；在低氧6 h后LC3B-Ⅱ、Beclin-1增加最為顯著(

P

<0.05)，而P62蛋白表達下降(

P

<0.05)；在低氧12 h后，LC3B-Ⅱ和P62蛋白表達水平雖有降低，但仍較對照組增高(

P

<0.05)，Beclin-1蛋白表達較對照組減少(

P

<0.05) (圖1)。以上結果表明低氧可以誘導H9C2心肌細胞的自噬，在低氧后6 h最為明顯。

圖1 低氧誘導H9C2心肌細胞自噬相關蛋白LC3B、Beclin-1和P62表達變化與對照組比較：*P<0.05

2.2 H9C2心肌細胞自噬過程中HDAC3蛋白表達增高

與對照組相比，低氧1 h和6 h后，H9C2心肌細胞中HDAC3蛋白表達顯著升高(

P

<0.05)；而在低氧12 h后，HDAC3蛋白表達明顯下降(

P

<0.05) (圖 2)。以上結果表明低氧可誘導H9C2心肌細胞自噬過程中HDAC3蛋白表達增高(

F

=353.60，

P

<0.05)。

圖2 低氧誘導H9C2心肌細胞HDAC3蛋白表達變化與對照組比較：*P<0.05

2.3 HDAC3促進了H9C2心肌細胞自噬

為了驗證HDAC3調控H9C2心肌細胞自噬的功能，通過細胞轉染HDAC3干擾RNA (H9C2+siRNA)下調HDAC3蛋白表達后。LC3B蛋白表達較對照組明顯降低(

P

<0.05)；而轉染HDAC3過表達質粒(H9C2+OE)上調HDAC3后，LC3B蛋白表達較對照組顯著增高(

P

<0.05)(圖 3A)。免疫熒光檢測發現，與對照組比較，下調的HDAC3降低了LC3B的熒光活性(

P

<0.05)，上調HDAC3增加了LC3B的熒光活性(

P

<0.05) (圖3B、3C)。以上結果表明HDAC3促進了低氧條件下H9C2心肌細胞自噬。

圖3 HDAC3促進H9C2心肌細胞LC3B的蛋白表達和熒光活性變化A：LC3B與HDAC3蛋白相對表達量；B：LC3B熒光活性變化；a：H9C2組；b：H9C2+siRNA NC組；c：H9C2+siRNA組；d：H9C2+OE NC組；e：H9C2+OE組；與H9C2組比較：*P<0.05

2.4 HDAC3負性調控mTOR分子表達

為了探討HDAC3促進H9C2心肌細胞自噬的分子機制，本課題研究調控細胞自噬的重要分子雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)的表達變化。與對照組比較，低氧后1 h 和6 h時mTOR蛋白表達逐漸增高，在12 h后表達降低(

P

<0.05)(圖 4A)。下調HDAC3 蛋白表達(H9C2+siRNA)后，mTOR蛋白水平和熒光活性明顯增高(

P

<0.05)；而上調HDAC3 蛋白表達(H9C2+OE)后，mTOR的蛋白水平和熒光活性顯著降低(

P

<0.05) (圖4B-4C)。以上結果提示HDAC3可以負性調控mTOR蛋白表達。

圖4 mTOR蛋白相對表達量及免疫熒光水平A：低氧誘導H9C2心肌細胞mTOR蛋白表達增高；B:HDAC3負性調控mTOR蛋白表達；C:HDAC3負性調控mTOR熒光活性；a：H9C2組；b：H9C2+siRNA NC組；c：H9C2+siRNA組；d：H9C2+OE NC組；e：H9C2+OE組；與H9C2組比較：*P<0.05

3 討論

自噬是細胞內蛋白質和亞細胞結構通過溶酶體降解的過程，是生理情況下細胞為適應各種刺激而維持其代謝的需要。應激狀態下異常自噬影響了細胞自身正常的形態和功能，導致多種疾病的發生發展，過度應激可導致自噬增強，自噬體累積，并且產生過度自噬而引發細胞自我消化死亡。心肌細胞自噬是心室重構的重要原因之一，研究心肌細胞自噬的分子機制對逆轉心室重構，以及對防治心力衰竭均有重要的意義。目前已有很多研究和實驗證明了心肌缺血再灌注時的心肌細胞自噬作用，這些研究結果提示缺血再灌注誘導的心肌細胞自噬進一步增加，而心肌細胞的自噬在心肌缺血初期是起到保護作用的，在再灌注期間才產生了惡化作用。

本課題首先體外建立低氧誘導H9C2心肌細胞自噬模型，研究自噬相關蛋白的LC3B-Ⅱ、Beclin-1和P62表達變化。在細胞自噬過程中，LC3B-Ⅱ蛋白的高表達提示自噬水平的增高，是重要的自噬分子標志物。在低氧后1、6、12 h，LC3B-Ⅱ蛋白表達均增高(

P

<0.05)。Beclin-1是自噬過程中核心蛋白之一，影響自噬體的形成，并能誘導細胞的凋亡。在低氧后1 h和6 h表達均較正常對照組增高，12 h后降低(

P

<0.05)。P62是一種多功能癌基因蛋白，通過不同的蛋白作用域參與細胞選擇性自噬過程。在低氧后1 h，P62蛋白表達增高，6 h后蛋白表達降低(

P

<0.05)，P62蛋白的這一變化和其他自噬研究結果相似。通過以上蛋白的檢測，驗證低氧誘導心肌細胞自噬成功。其中，在低氧后6 h，自噬水平最為顯著，因此選取低氧6 h作為后續實驗的時間點。

HDAC3是表觀遺傳學調控的重要分子，在機體內廣泛分布，和心肌細胞肥厚和凋亡以及心肌纖維化和先天性心臟病的發生發展均有密切聯系。研究顯示，HDAC3參與了低氧復氧條件下腎小管上皮細胞的自噬。但是，HDAC3在心肌細胞自噬過程的功能和機制尚不明確。本研究發現，在低氧誘導H9C2心肌細胞自噬的過程中，HDAC3的蛋白表達增加，低氧6 h時最為顯著。12 h后H9C2心肌細胞出現明顯的死亡現象，HDAC3的表達有所降低。為了研究HDAC3調控H9C2心肌細胞自噬的功能，體外分別轉染HDAC3過表達質粒和干擾RNA。研究發現細胞轉染過表達質粒能夠明顯上調H9C2細胞中HDAC3蛋白表達，而干擾RNA能夠明顯降低HDAC3蛋白表達。進一步研究發現，上調HDAC3后LC3B蛋白表達增加和熒光活性增高，而下調HDAC3后LC3B蛋白表達降低和熒光活性減少。這些結果表明在低氧情況下，HDAC3促進了H9C2心肌細胞自噬。mTOR是能夠參與多種信號通路的調節分子，在細胞凋亡和自噬過程中具有重要的作用。在H9C2心肌細胞自噬的過程中，mTOR蛋白表達增加，但HDAC3是否通過調控mTOR來實現促進心肌細胞自噬的機制并不清楚。本研究發現，上調HDAC3后mTOR蛋白表達降低和熒光活性減少，而下調HDAC3后mTOR蛋白表達升高和熒光活性增加，提示了在H9C2心肌細胞自噬的過程中，HDAC3負性調控mTOR的表達。

低氧誘導H9C2心肌細胞自噬和HDAC3的表達具有時間特異性。HDAC3負性調節mTOR蛋白，促進了低氧誘導的H9C2心肌細胞自噬。本研究闡述了心肌細胞自噬的可能分子機制，為預防心室重構和心力衰竭提供了新的思路和治療靶點。