星狀神經節阻滯術對大鼠急性心肌梗死后炎癥反應的影響

徐曈，馮作炫，周凡，朱藝霞，王明虹

（寧德市醫院麻醉科，福建寧德352100）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是目前臨床上常見的心血管疾病之一，有病情進展迅速、患者預后差、致死率較高的特點。過度炎癥反應與AMI 后心肌損傷、心室重構等密切相關[1-3]。有研究發現，AMI 發生后患者會出現急性炎癥反應和中性粒細胞浸潤，分泌大量的炎癥因子，導致心肌細胞進一步受損，加重心肌組織損傷，進而導致血清心肌損傷標志物水平上升[4-5]。有文獻報道，星狀神經節阻滯術（stellate ganglion block, SGB）可抑制心肌梗死后室性心律失常，且對心肌損傷有一定的保護作用[6-7]。但SGB 對心肌梗死后炎癥反應的影響尚不清楚，本研究主要探討SGB 對大鼠AMI 后心肌細胞炎癥反應的影響及對心肌損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司），實時熒光定量PCR 儀（上海楓嶺生物技術有限公司），普通PCR 儀（美國Bio-Rad 公司），酶標儀（美國Molecular Devices公司），全自動生化分析儀（美國羅氏公司），Trizol（美國Invitrogen 公司），逆轉錄試劑盒及PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司），白細胞介素6（Interleukin-6,IL-6）、白細胞介素1β（Interleukin-1β, IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和GAPDH 引物（深圳華大基因科技有限公司），IL-6、IL-1β 及TNFα ELISA 試劑盒（美國Abcam 公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理選取8 周齡雄性SPF 級Wistar 大鼠60 只[實驗動物生產許可證：SCXK(閩）2018-003，實驗動物使用許可證：SYXK(閩）2018-009]，購自于廈門大學。大鼠體重200～250 g，隨機分為假手術組、AMI 組和SGB 組，每組20 只。飼養條件：在溫度為22℃恒溫，濕度60%，明暗交替各12 h，自由攝食、飲水。大鼠適應環境1 周后進行相應處理。假手術組只打開胸腔暴露心臟，不結扎冠狀動脈；AMI 組結扎冠狀動脈左前降支并復制AMI 模型，AMI 模型復制成功的標準為心電圖至少有2 個相關導聯ST 段抬高>0.2 mV，且可見血管結扎部位下有局部心肌缺血呈暗紫色；SGB 組在AMI 模型復制成功后行SGB，暴露左側頸總動脈，在動脈分叉處的背側面注射0.2 ml 0.25%羅哌卡因。SGB 成功標準：阻滯側約10 min 后出現Horner 征。造模后1 周采集各組大鼠心臟組織。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）采用qRT-PCR 檢測各組大鼠心肌組織中炎癥因子IL-6、IL-1β 及TNF-α mRNA 的水平。稱取大鼠心肌組織50 mg，采用電動勻漿器將組織研磨成單細胞懸液，離心后棄上清取沉淀。采用TRIzol 法提取心肌組織的總RNA，并將RNA 逆轉錄為cDNA。以cDNA 為模板進行qRT-PCR。反應體系：ddH2O 8.9 μl，正反向游引物各0.8 μl，SYBR Green 12.5 μl，cDNA 2 μl，共25 μl。反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性10 s，58℃退火30 s，共40 個循環。IL-6、IL-1β及TNF-α mRNA 相對表達水平以GAPDH 的表達水平作為參照，2?△△Ct法計算目的基因的相對表達量。qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 酶聯免疫吸附試驗（enzymelinked immuno‐sorbent assay, ELISA）采用ELISA 法檢測各組大鼠血清中炎癥因子IL-6、IL-1β 及TNF-α 的表達水平。稱取心肌組織50 mg，采用電動勻漿器將組織研磨成單細胞懸液，離心后棄上清取沉淀。采用超聲波破碎儀破碎心肌細胞，離心取上清進行試驗。按試劑盒說明書進行ELISA，步驟如下：①按說明書準備所有試劑、樣品和標準品；②每孔加50 μl 標準品或樣品；③每孔加50 μl Antibody cocktail；④室溫條件下孵育1 h；⑤吸去液體，加350 μl Wash Buffer，重復3 次；⑥每孔加100 μl TMB Development Solution，室溫條件下孵育10 min；⑦每孔加100 μl Stop Solution，450 nm 處讀取吸光度值，并計算濃度。

1.2.4 檢測血清中心肌酶含量實驗結束后采集大鼠腹主動脈血5 ml，3 000 r/min 離心20 min，分離血清，置于4℃冰箱保存，采用全自動生化分析儀檢測大鼠血清中心肌酶[谷草轉氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）]水平。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，兩兩比較采用SNK-q 法。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心肌組織中炎癥因子IL-6、IL-1β及TNF-α mRNA相對表達量比較

AMI 組、SGB 組、假手術組IL-6 mRNA 相對表達量分別為（29.66±3.17）、（19.72±8.18）和（1.00±1.00），經方差分析，差異有統計學意義（F=230.500，P=0.000）。AMI 組、SGB 組、假手術組IL-1β mRNA 的相對表達量分別為（16.65±2.65）、（11.95±2.84）和（1.00±1.00），經方差分析，差異有統計學意義（F=256.300，P=0.000）。AMI 組、SGB 組、假手術組TNF-α mRNA 的相對表達量分別為（17.99±4.12）、（14.80±1.73）和（1.00±1.00），經方差分析，差異有統計學意義（F=245.600，P=0.000）。SGB 組IL-6、IL-1β 及TNF-α mRNA 的相對表達量均較AMI 組降低（P<0.05）。見圖1、2。

圖1 qRT-PCR擴增曲線

圖2 qRT-PCR熔解曲線

2.2 各組大鼠血清中炎癥因子IL-6、IL-1β 及TNF-α表達水平比較

假手術組、AMI 組和SGB 組IL-6 表達水平分別為（22.75±4.10）μg/ml、（53.33±8.95）μg/ml和（42.05±3.16）μg/ml，經方差分析，差異有統計學意義（F=134.000，P=0.000）；假手術組、AMI 組和SGB 組IL-1β 表達水平分別為（16.09±5.14）μg/ml、（91.30±5.80）μg/ml 和（51.89±4.47）μg/ml，經方差分析，差異有統計學意義（F=1 060.000，P=0.000）；假手術組、AMI 組和SGB 組TNF-α 表達水平分別為（31.33±6.80）ng/ml、（82.44±8.60）ng/ml 和（63.21±6.49）ng/ml，經方差分析，差異有統計學意義（F=246.300，P=0.000）。AMI 組、SGB 組IL-6、IL-1β及TNF-α 表達水平較假手術組升高（P<0.05），SGB組IL-6、IL-1β 及TNF-α 表達水平較AMI 組降低（P<0.05）。

2.3 各組大鼠血清中心肌酶表達水平比較

假手術組、AMI 組和SGB 組AST 表達水平分別為（15.57±6.28）u/L、（75.13±10.51）u/L 和（41.70±9.49）u/L，經方差分析，差異有統計學意義（F=222.800，P=0.000）；假手術組、AMI 組和SGB 組LDH 表達水平分別為（159.96±28.19）u/L、（252.50±34.83）u/L 和（202.87±34.36）u/L，經方差分析，差異有統計學意義（F=40.350，P=0.000）；假手術組、AMI 組和SGB 組CK-MB 表達水平分別為（14.21±6.45）u/L、（77.0.3±7.80）u/L 和（45.44±7.78）u/L，經方差分析，差異有統計學意義（F=363.200，P=0.000）。AMI 組、SGB 組AST、LDH 及CK-MB 表達水平較假手術組升高（P<0.05），SGB 組AST、LDH 和CK-MB表達水平較AMI 組降低（P<0.05）。

3 討論

據世界衛生組織統計，全球每年約1 200 萬人死于心腦血管疾病，其中AMI 是主要原因之一[8-9]。所謂AMI 是指由于冠狀動脈阻塞導致心肌持續性缺血缺氧所引起的心肌壞死。AMI 后機體的促炎作用可使機體炎性介質增加，促進心肌炎癥細胞浸潤，使梗死的心肌組織釋放溶酶體酶和氧化應激物質[10-12]。此外，AMI 后由于左心室節段性收縮和舒張功能降低，機體啟動代償機制來緩解心肌細胞的缺氧狀態，導致心肌細胞反應性伸長，梗死區室壁變薄，最終影響心臟血流動力學和心臟功能的降低[13-14]。因此，炎癥反應在AMI 患者的預后中發揮著舉足輕重的作用。IL-6、IL-1β 及TNF-α 是機體炎癥反應過程中重要的調節因子，能夠通過激活中性粒細胞調節炎癥反應。有研究發現，IL-6、IL-1β 及TNF-α 參與炎癥性免疫細胞介導的心肌損傷過程，且AMI 患者血清IL-6、IL-1β 及TNF-α 水平顯著上升[15-16]。本研究結果顯示，AMI 組大鼠心肌組織和血清IL-6、IL-1β 及TNF-α 含量均明顯高于假手術組，與以往報道一致。

心外膜密集分布于冠狀動脈和冠狀小動脈上交感神經，交感神經的功能狀態與心肌梗死、心絞痛及嚴重的心率失常密切相關[17-18]。交感神經過度興奮可使正常或者已發生病變的冠狀動脈收縮進而引起心肌缺血性疼痛，甚至心肌梗死，且心肌缺血的痛覺傳入神經就是交感神經。星狀神經節是頸部交感神經節之一，由頸下神經節與第1 胸交感神經節融合而構成，星狀神經節發出的心下神經沿鎖骨下動脈后方，氣管的前方下降，加入心叢而參與心臟的活動。而SGB 是指通過阻滯交感神經的活性，達到緩解疼痛，較少心肌做功，降低心肌耗氧，擴張收縮的冠狀動脈，改善心肌血流分布，抑制機體應激反應，從而減少應激激素的釋放，最終阻斷疼痛引起的惡性循環[19]。有文獻報道，頭面部及上胸部帶狀皰疹行SGB 可阻斷疼痛的傳導，改善血行，增強防御能力，有抗炎作用，且能縮短病程[20-21]。但SGB 在AMI 中是否有抗炎作用尚未見報道。本研究結果顯示，SGB 組大鼠心肌組織和血清炎癥因子IL-6、IL-1β 及TNF-α 含量均低于AMI 組，且SGB 組大鼠血清中心肌酶AST、LDH 和CK-MB 含量也低于AMI 組，提示SGB 可能通過抑制炎癥反應減少心肌細胞的損傷，但具體機制仍不清楚，有待進一步研究。