右歸丸對骨性關節炎模型大鼠TGF-β1/Smads信號通路的影響

劉洋 孫權 楊砥 秧榮昆 徐遠坤

貴州中醫藥大學第一附屬醫院，貴州 貴陽 550002

中醫認為骨性關節炎屬于痹癥與痿證，肝腎虧虛、長期勞損與外感風寒濕邪為其主要病機。右歸丸出自《景岳全書》，主要成分有熟地黃、附子(炮附片)、肉桂、山藥、山茱萸(酒炙)、菟絲子、鹿角膠、枸杞子、當歸、杜仲(鹽炒)，具有溫陽補腎、填精補髓之功效。研究證實，右歸丸對骨性關節炎具有治療作用，可通過抑制基質金屬蛋白酶活性和炎癥因子表達來抑制軟骨退變[1]，但其對骨性關節炎的作用機理仍需要探討。

國內外的研究主要從細胞因子、免疫反應及基質金屬蛋白酶等幾方面探討骨性關節炎的發病機制，但尚未形成統一的觀點[2-4]。近年來，人們將研究的重點集中到對軟骨生物學標志物的研究，同時與其相關的細胞信號轉導通路也成為探討骨性關節炎發病機制的重要手段。目前的研究證實 Smad 轉導的 TGF-β家族信號可以通過多種機制對軟骨細胞的增殖、分化和成熟進行精密調控[5-6]。本研究采用經典的Hulth法建立膝骨性關節炎模型，并給予右歸丸灌胃干預，進一步探討右歸丸對骨性關節炎軟骨的保護作用及可能的作用機理。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

右歸丸購自北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠(國藥準字Z11021040，批號11030027)，由熟地黃 24 g、山藥 12 g、山茱萸 9 g、枸杞子 9 g、鹿角膠 12 g、菟絲子 12 g、杜仲 12 g、當歸9 g、肉桂 6 g、制附子 6 g 等組成。換算成大鼠用量為：111 g ×0.018×5≈10 g/kg，以此為中劑量，預實驗比較了5、10、20 g/ kg的治療效果，其中20 g/kg治療效果最好，所以實驗選擇了此濃度進行實驗；TGF-β/Smad通路抑制劑(SB431542，批號：SF7890，碧云天生物技術有限公司)；腫瘤壞死因子α ELISA檢測試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，批號：ARB13479)；白細胞介素1β ELISA檢測試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司，批號：SBJ-R0024)；兔抗鼠COL-Ⅱ多克隆抗體(武漢云克隆科技股份有限公司，批號：PAA572Rb51)；兔抗鼠MMP-13多克隆抗體( 上海生工生物工程股份有限公司，批號：D120098-0025)；兔抗鼠TGF-β1(武漢菲恩生物科技有限公司，批號：FNab08638)；兔抗鼠Smad2(武漢菲恩生物科技有限公司，批號：FNab07993)；(武漢益普生物科技有限公司，批號：ATA37717)；兔抗鼠p-Smad2(上海信裕生物科技有限公司，批號：IC195026)；兔抗鼠p-Smad3(上海鈺博生物科技有限公司，批號：IC187103)。

1.2 實驗動物

成年SD大鼠64只，由貴州醫科大學實驗動物中心提供，許可證證號：SCXK(黔)2018-0001，雌雄各半，體重200～230 g，SPF級，單籠飼養，自由進食水，自然光線照射，相對濕度為50 %～60 %，飼養環境溫度為(23±2) ℃，飼養于貴州醫科大學實驗動物中心實驗動物中心。

1.3 動物分組與處理

將64只SD大鼠利用隨機數字表法分為正常組、模型組、右歸丸組、抑制劑組，每組15只。正常組不做任何處理，模型組、右歸丸組、抑制劑組采用經典的Hulth法[7]建立膝骨性關節炎模型。術后6周制作右膝關節軟骨病理切片證實造模成功。造模6周后，右歸丸組灌服20 g/kg的右歸丸(右歸丸常規水煎制成2 g/mL的藥液，灌服體積為10 mL/kg)[8]；抑制劑組腹腔注射1.2 mg/kg的SB431542[9]，同時灌服20 g/kg的右歸丸；模型組灌服等劑量的生理鹽水；3組每天給藥1次，連續給藥8周。

1.4 軟骨組織病理形態觀察

末次給藥24 h后麻醉大鼠，取右膝關節軟骨組織，其中一部分置于-80 ℃環境中保存，另一部分置于體積分數10 %甲醛中固定。固定24 h后取出關節軟骨組織，脫鈣處理后依次進行水合、透明、石蠟包埋處理，切片，切片厚度約5 μm，常規HE染色。同時番紅O染色后進行Mankin 評分，評分低說明關節軟骨損傷程度低。

1.5 ELISA法檢測軟骨組織中炎癥因子水平

取出-80 ℃保存的軟骨組織，在1 mg軟骨組織中添加9 mg/L的生理鹽水，置于勻漿器內制備勻漿液，5 000g離心10 min后收集上清液，利用ELISA檢測試劑盒檢測腫瘤壞死因子α與白細胞介素1β水平。

1.6 免疫組化染色

將切片置于枸櫞酸緩沖液盒中進行微波修復2 min，加入3 %過氧化氫溶液室溫孵育半小時，加入5 %山羊血清封閉抗原半小時，采用免疫組化染色觀察軟骨組織中Ⅱ型膠原蛋白與基質金屬蛋白酶13(MMP-13)陽性表達。

1.7 RT-PCR檢測

采用RT-PCR法檢測軟骨組織中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達。將50 mg冷凍的軟骨組織置于液氮中研磨成粉末，制成勻漿液；加入氯仿后混勻，4 ℃ 12 000g離心10 min；按照 RNeasy? Lipid Tissue Mini Kit 試劑盒說明書操作提取總RNA。取各組樣品總RNA 1 μL，利用核酸蛋白分析儀檢測總RNA水平。PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser說明書操作進行反轉錄反應。將合成的cDNA進行RT-PCR反應，引物序列見表1。

表1 RT-PCR反應引物序列Table 1 Primer sequence of RT-PCR

1.8 Western blot檢測

取軟骨組織，將50 mg軟骨組織放入研磨皿中裂解，將勻漿組織液12 000g離心3 min，取上清，95 ℃煮沸10 min變性，-20 ℃保存。采用BCA法檢測蛋白濃度。取20 μL蛋白樣品，加入5 μL的6×蛋白上樣緩沖液混勻，加熱5 min后冷卻；按預定的順序上樣、恒壓電泳，將目的蛋白轉移至PVDF膜上，脫脂牛奶封閉1 h，加入稀釋的一抗(兔抗鼠TGF-β1、未磷酸化Smad2、未磷酸化Smad3、p-Smad2、p-Smad3，稀釋度分別為1∶1 000、1∶10 000、1∶5 000、1∶10 000、1∶5 000)4 ℃孵育過夜；加入二抗羊抗兔IgG(稀釋度分別為1∶2 000)室溫孵育1 h，以β-actin為內參；ECL顯影、曝光。

1.9 統計學處理

利用SPSS 22.0 軟件對所有實驗數據進行統計分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較差異采用t或t’檢驗。實驗結果以均數±標準差表示。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模動物一般情況

實驗期間造模動物無死亡。造模后，大鼠飲食、精神狀態及活動情況較差，膝關節腫脹。

2.2 軟骨組織病理形態觀察

HE染色顯示，正常組軟骨組織表層細胞較小呈梭形，排列密集，中間層可見呈圓形或橢圓形的細胞，排列不規律，潮線清晰完整；模型組軟骨表面不規則，大部分軟骨表層細胞消失，軟骨細胞數量顯著減少，潮線紊亂甚至消失。抑制劑組與右歸丸組軟骨細胞形態與數量較模型組均有不同程度的改善，其中右歸丸組軟骨細胞大致趨于正常，潮線較完整。各組具體HE染色結果見圖1。

注：a、b 正常組；c、d 模型組；e、f 抑制劑組；g、h 右歸丸組。圖1 軟骨組織形態學觀察(200×，n=15)Fig.1 Histological Observation of cartilage(200×，n=15)

番紅-O染色顯示，正常組潮線清晰完整；模型組潮線破壞較嚴重，不完整；抑制劑組潮線欠完整；右歸丸組潮線較清晰且較完整。各組番紅-O染色結果見圖1。Mankin 評分評估結果顯示，模型組評分明顯高于正常組(P<0.05)，抑制劑組、右歸丸組低于模型組(P<0.05)，右歸丸組低于抑制劑組(P<0.05)，見表2。

2.3 軟骨組織中炎癥因子濃度

與正常組比較，模型組軟骨組織中腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，抑制劑組、右歸丸組腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β水平顯著降低(P<0.05)；與抑制劑組比較，右歸丸組腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β水平顯著降低(P<0.05)，具體結果見表2。

表2 軟骨組織Mankin 評分與炎癥因子濃度(n=15)

2.4 免疫組化染色

正常組軟骨組織中Ⅱ型膠原蛋白陽性染色廣泛分布、著色深，MMP-13陽性染色較少、著色淺；模型組軟骨組織中Ⅱ型膠原蛋白陽性染色顯著減少、著色淺，MMP-13陽性染色廣泛分布、著色深；抑制劑組、右歸丸組Ⅱ型膠原蛋白陽性染色較模型組廣泛、著色深，MMP-13陽性染色明顯減少、著色變淺，見圖2與圖3。

圖2 軟骨組織內Ⅱ型膠原蛋白陽性表達(免疫組化，400×，n=15)Fig.2 Positive expression of type II collagen in cartilage (immunohistochemistry, 400×，n=15)

圖3 軟骨組織內MMP-13陽性表達(免疫組化，400×，n=15)Fig.3 MMP-13 positive expression in cartilage tissue (immunohistochemistry, 400×，n=15)

模型組Ⅱ型膠原蛋白累積光密度值低于正常組，而MMP-13累積光密度值高于正常組(P<0.05)；抑制劑組Ⅱ型膠原蛋白累積光密度值高于模型組，MMP-13累積光密度值低于模型組(P<0.05)；右歸丸組Ⅱ型膠原蛋白累積光密度值高于抑制劑組，MMP-13累積光密度值低于抑制劑組(P<0.05)，具體數據見表3。

表3 軟骨組織Ⅱ型膠原蛋白與MMP-13累積光密度值(n=15)

2.5 RT-PCR檢測

模型組TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達較正常組顯著降低(P<0.05)，抑制劑組TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 mRNA表達高于模型組(P<0.05)，右歸丸組TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達高于抑制劑組(P<0.05)，具體數據見表4。

表4 軟骨組織內TGF-β1、Smad2、Smad3表達(n=15)Table 4 The expression of TGF - β 1, Smad2 and p-Smad3 in cartilage tissue(n=15)

2.6 Western blot檢測

Western blot檢測結果顯示，4組間未磷酸化Smad2、Smad3蛋白表達差異無統計學意義；模型組TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 蛋白表達較正常組顯著降低(P<0.05)，抑制劑組TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3 蛋白表達高于模型組(P<0.05)，右歸丸組TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白表達高于抑制劑組(P<0.05)，具體數據見表4。4組未磷酸化Smad2、未磷酸化Smad3、TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3蛋白條帶見圖4。

圖4 軟骨組織內TGF-β1/Smads信號通路蛋白表達條帶(n=15)Fig.4 The Expression of TGF - β1 / Smads signaling pathway protein in cartilage(n=15)

3 討論

本研究采用經典的Hulth法建立膝骨性關節炎模型，該方法主要通過手術破壞關節力學穩定性，進而導致骨性關節炎，發病機制與臨床類似。本實驗結果顯示，造模后大鼠的軟骨退變評分明顯升高，病理組織形態學顯示軟骨表面不規則，結構紊亂，軟骨細胞數量明顯減少，潮線消失，Mankin 評分明顯升高，與以往研究中骨性關節炎動物模型病理改變相似[10-11]，證實本實驗造模成功。

《內經》中記載“腎主骨、肝主筋”, 依據這一中醫理論, 認為骨性關節炎的主要病機特點是“肝腎虧虛為本，氣滯、血瘀、痰濕凝聚為標”，中醫宜采用“補肝腎、強筋骨、活血、祛瘀、止痛” 等中藥治療骨性關節炎。右歸丸作為一種補腎方藥含有多種有效成分，多藥共同作用可溫腎陽而兼顧陰陽，滋補肝脾腎，用于多種疾病的治療。該方中附子、肉桂、鹿角膠培補腎中元陽里祛寒，為君藥；熟地黃、山茱萸、枸杞子、山藥滋陰益腎，養肝補脾，填精補髓，取“陰中求陽” 之義，為臣藥；再用菟絲子、杜仲補肝腎，強腰膝，配以當歸養血和血，共補肝腎精血，為佐藥。諸藥合用，以溫腎陽為主而陰陽兼顧，肝脾腎并補，妙在陰中求陽，使元陽得以歸原。研究證實，補腎中藥可減緩大鼠膝關節骨性關節炎的退變，起到保護膝關節的作用[12-13]。本研究結果表明，相較于模型組，右歸丸組關節軟骨退變Mankin 評分顯著降低，軟骨組織病理形態明顯改善，證實右歸丸可抑制軟骨退變，減輕軟骨損傷，具有治療作用。

多型膠原、關節液與細胞外基質共同組成了關節軟骨細胞微環境，其中Ⅱ型膠原蛋白是其中含量最高的膠原之一，生理狀態下的軟骨細胞主要分泌Ⅱ型膠原蛋白，但當軟骨受損會影響細胞微環境，導致Ⅱ型膠原蛋白含量增加，進而破壞軟骨結構[14]。另外，促炎癥因子活化后加重炎癥反應，通過降低軟骨組織內的Ⅱ型膠原蛋白含量而誘導基質中的基質金屬蛋白酶13釋放，進一步降解Ⅱ型膠原蛋白。本研究結果顯示，右歸丸可減輕軟骨組織內的炎癥反應，平衡細胞外基質膠原表達，保護關節軟骨組織。

TGF-β1在關節軟骨發育中具有重要的作用。正常情況下，內環境中的TGF-β1通過與細胞表面的特異性受體結合來引發下游Smad家族的活化，引發一系列的信號傳遞，或者是與一些轉錄因子形成復合體，活化或抑制特定基因的表達。TGF-β1信號通路可以調控正常細胞的周期，調節其生長、增殖與分化等，并促進衰老細胞凋亡，維持機體正常狀態。TGF-β1可促進軟骨細胞中Ⅱ型膠原蛋白與蛋白聚糖的合成與分泌，提示TGF-β1在關節軟骨發育中發揮著重要作用[15]，對骨性關節炎的關節軟骨發揮保護作用。此外，也有一些研究者認為TGF-β1可誘發骨性關節炎[16]。所以，對于TGF-β1在骨性關節炎中的作用及其相關的信號通路仍有待更深入的探討與研究。本研究結果顯示，右歸丸可能通過激活TGF-β1/Smads信號通路來發揮關節軟骨保護作用的。為了進一步驗證實驗推測，本實驗采用TGF-β1/Smads信號通路抑制劑對右歸丸干預骨性關節炎模型大鼠進行處理，結果顯示：軟骨形態損傷加重，軟骨組織病理評分升高，軟骨組中的炎癥因子腫瘤壞死因子α與白細胞介素1β水平升高，基質金屬蛋白酶13陽性表達增加，Ⅱ型膠原蛋白陽性表達減少，提示右歸丸可能通過激活TGF-β1/Smads信號通路延緩骨性關節炎關節軟骨退變，減輕軟骨炎癥反應，維持軟骨細胞外基質平衡，進而發揮軟骨保護作用。遺憾的是本研究未設置骨性關節炎模型大鼠單獨TGF-β1/Smads信號通路抑制劑干預組，因此對于TGF-β1/Smads信號通路在骨性關節炎中作用機制仍需進一步明確。

綜上，右歸丸可減輕軟骨組織內的炎癥反應，平衡細胞外基質膠原表達，保護關節軟骨組織，其作用機制可能與TGF-β1/Smads信號通路有關。