基于生物信息學探討骨質疏松癥與肌少癥的關系

商海濱 廉由之 郭海玲 楊光月 鄧真 艾有利 陳蓓 李國中 趙詠芳*

1.上海市寶山區中西醫結合醫院 上海中醫藥大學附屬曙光醫院寶山分院，上海 201999 2.上海中醫藥大學附屬曙光醫院石氏傷科醫學中心，上海 201203 3.上海市中醫藥研究院骨傷科研究所，上海 201203

世界衛生組織(World Health Organization，WHO)提出“健康老齡化”的概念，不僅要求壽命延長，更要求壽命質量的提高。肌少癥(sarcopenia)可導致肌肉量及肌肉強度下降，骨質疏松癥(osteoporosis)可引起骨量及骨骼功能的下降，嚴重影響了老年人的生活質量。由于目前對于肌少癥的相關研究仍處于初步階段。若探尋到骨質疏松癥與肌少癥的共同發病機制，那對于骨質疏松癥與肌少癥的治療將起到事半功倍的效果。鑒于骨質疏松癥與肌少癥均為多基因通路調控，涉及多器官、多系統、多靶點的全身代謝性疾病。利用分子生物學技術，通過多組基因數據整合分析，探討骨質疏松癥并發肌少癥的發病機制具有極為重要的現實意義，這將為同時治療兩種疾病的藥物的精確研究提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 數據庫與軟件

CTD數據庫[1]、Disgenet數據庫[2](2020年V7.0版)、TTD數據庫[3]、OMIM 數據庫[4]、GeneCards數據庫[5]、Drugbank數據庫[6]、KEGG數據庫[7]，STRING網站[8]，Perl軟件、R語言軟件，UniProt知識庫，Cytoscape 3.7.2軟件[9]。

1.2 方法

分別以“Osteoporosis”、“Sarcopenia”為關鍵詞，檢索目前公認的主要的疾病數據庫來獲得骨質疏松癥與肌少癥相關靶點，其中包括CTD、Disgenet、TTD、OMIM、GeneCards、Drugbank、KEGG數據庫。分別獲得影響該疾病的靶點基因。隨后，將所獲得靶點分別進行匯總、篩選、去重后即得到該疾病的靶點基因。利用R語言軟件將Osteoporosis靶點基因與Sarcopenia靶點基因取交集，得到Osteoporosis-Sarcopenia共同靶點基因，利用STRING網站對Osteoporosis-Sarcopenia共同靶點基因進行蛋白互作網絡分析，并進行基因GO富集分析和KEGG通路分析。

2 結果

2.1 基因篩選結果

CTD數據庫中骨質疏松癥和肌少癥相關基因分別為807和113個；Disgenet數據庫中1 098和164個；TTD數據庫中24和0個；OMIM數據庫中69和4個；GeneCards數據庫中346和200個；Drugbank數據庫中24和0個；KEGG數據庫中13和0個。匯總數據、刪除重復基因，最終得到骨質疏松癥相關基因1 782個，肌少癥相關基因429個。

2.2 兩種疾病靶點的交集分析

利用R語言軟件將Osteoporosis靶點基因與Sarcopenia靶點基因取交集，得到Osteoporosis-Sarcopenia共同靶點基因共計171個，形成兩種疾病靶點基因的韋恩圖(見圖1) 。其中，骨質疏松癥與肌少癥的共同靶點基因，見表1。

表1 骨質疏松癥與肌少癥的共同靶點基因列表Table 1 The list of the common target genes of osteoporosis and sarcopenia

圖1 骨質疏松癥與肌少癥的共同靶點基因的韋恩圖Fig.1 Venny diagram of the common target genes of osteoporosis and sarcopenia

2.3 靶點基因/蛋白互作網絡分析

利用STRING網站對Osteoporosis-Sarcopenia共同靶點基因進行蛋白互作網絡分析，其中，置信度設置為0.90，隱藏獨立靶點，形成了蛋白互作網絡分析的(詳見圖2)PPI分析圖(左)并利用R語言軟件計算得到barplot圖(右)。由于靶基因之間的節點數目反映該基因在此過程中發揮作用的強弱，AKT1、PI3K在骨質疏松癥和肌少癥發病過程中可能發揮了重要作用。

2.4 GO分析與Pathway富集分析

本研究采用了cluego插件，對骨質疏松癥與肌少癥以及共同靶點基因中的關鍵靶點及信號通路進行GO富集分析和KEGG通路富集分析。其中，節點的大小代表了該信號通路的顯著性，信號通路的顯著性越高，節點越大，說明該通路的重要性越高。其中，骨質疏松癥GO分子功能富集分析見表2左側，肌少癥GO分子功能富集分析見表2右側，共同靶點基因GO分析結果見圖3。在KEGG通路富集分析過程中，其中，骨質疏松癥KEGG通路富集分析見表3左側，肌少癥KEGG通路富集分析見表3右側，共同靶點基因KEGG通路富集分析結果見圖4。

注：左 PPI分析圖；右 barplot圖圖2 骨質疏松與肌少癥共同靶點基因的蛋白互作網絡分析的Fig.2 The PPI plot (left) and bar plot (right) of protein interaction network analysis of the common target genes of osteoporosis and sarcopenia

表2 骨質疏松癥與肌少癥各自GO分子功能富集分析結果表Table 2 Results of GO enrichment analysis of osteoporosis and sarcopenia

續表2

圖3 骨質疏松癥與肌少癥共同靶點GO分析結果圖Fig.3 Results of GO analysis of the common targets of osteoporosis and sarcopenia

表3 骨質疏松癥與肌少癥各自靶點KEGG通路富集分析結果列表Table 3 The list of KEGG pathway analysis results of the common targets of osteoporosis and sarcopenia

圖4 骨質疏松癥與肌少癥共同靶點KEGG通路富集分析結果Fig.4 Enrichment analysis results of KEGG pathway of the common target of osteoporosis and sarcopenia

3 討論

2019年亞洲肌少癥工作組(Asian Working Group for Sarcopenia, AWGS)最新共識[10]指出，亞洲老年肌少癥的患病率在5.5 %至25.7 %之間，而中國療養院中老年肌少癥患病率在31.4 %以上[11]。骨質疏松癥和肌少癥均為增齡性疾病，2013年，Binkley[12]提出將肌少癥伴有骨質疏松癥作為一種疾病——“活動障礙綜合征”(dysmobility syndrome)。本病可導致老年人機體平衡能力下降，易跌倒發生脆性骨折，最終導致老年人的生活質量降低[13]。2018年中國與歐洲在骨質疏松與肌少癥的診斷、治療方面進行了相互交流[14]，但尚未有明確結果。本研究基于生物信息學以及現代大數據信息技術，通過檢索大型疾病數據庫并進行綜合分析，最終使骨質疏松癥與肌少癥之間的共同靶點基因信息可視化。

圖表分析可知，骨質疏松癥主要涉及PI3K-Akt、MAPK、Ras、Rap1、TNF、cAMP、JAK-STAT、FoxO、Chemokine、NOD樣受體以及HIF-1等信號通路。其中多數通路已被廣泛研究。如本研究中靶基因數最多的通路為PI3K-Akt信號通路，以往研究表明該通路與成骨和破骨通路緊密聯系，調控著成骨細胞和破骨細胞存活、分化過程從而維持骨量和骨轉換平衡[15]。朱云艷等[16]發現，Toll樣受體通路過表達可引起MAPK以及Akt 磷酸化水平的下降。田愛現等[17]在骨質疏松關聯性分子信號通路的論述中，PI3K-Akt、TNF等多種信號通路均有涉及。李近等[18]綜合分析認為FoxOs可調節骨形成和骨吸收的動態平衡進而影響骨組織的微結構和骨質量。鐘航等[19]認為絕經后骨質疏松癥中破骨細胞內HIF-1信號通路的上調可能與Akt、ERK等信號通路有關。肌少癥主要涉及PI3K-Akt、JAK-STAT、MAPK、長壽調控、FoxO、AMPK、Insulin、HIF-1、mTOR等信號通路。多數通路已被廣泛研究，但關于具體信號通路與肌少癥如何發病的相關研究較少。楊明等[20]認為肌少癥與IGF/PI3K/Akt/mTOR信號通路，維生素D及多種激素均有密切關系，但關于肌少癥相關的信號通路的研究仍有待進一步深化。

我們分析得到骨質疏松癥與肌少癥的部分信號通路是重疊的，這表明兩種疾病之間可能存在共同的發病機制。其主要包括PI3K-Akt、長壽調控、FoxO，AGE-RAGE、HIF-1、AMPK、JAK-STAT、MAPK、Insulin、TNF以及Apoptosis過程。已有研究提示，在PI3K/Akt通路中，IGF-1通過PI3K/Akt和MAPK/ERK信號通路激活IGF-1R[21]。IGF-1可誘導肌肉肥大，進而促進骨骼發育和骨量的保存，然而GH的缺乏則會導致肌肉和骨量減少。同時，血清IGF-1水平與瘦體量和骨折風險降低呈正相關。Demontiero等[22]的研究表明肌少癥與骨質疏松癥患者的IL-6 和TNF-α水平較高相關。由于肌肉和骨骼組成人體的肌骨運動系統，兩者緊密關聯。肌肉是調節骨骼潛在細胞、信號的重要來源，骨骼的內分泌或旁分泌作用可調控肌肉發育、肌量與肌力。骨質疏松癥與肌少癥均為復雜代謝性疾病，涵蓋眾多差異表達基因，均擁有龐大的疾病基因表達網絡，涉及眾多信號通路，并且網絡之間密不可分。對于這兩種疾病的防治應針對骨骼和骨骼肌之間的相互關系和共同作用靶點，運用綜合有效的干預措施。

本研究擬探尋骨質疏松癥與肌少癥疾病過程中存在的高度重合的差異基因表達以及相關信號通路，進而針對共同靶點或通路進行調控，為臨床治療骨質疏松癥與肌少癥提供理論依據。當然，本研究存在一定弊端，基因的正向負向調控表達與激活程度未在數據庫中顯示，這需要生物信息學以及疾病數據庫后續的不斷完善。同時，本研究結果仍需要后續進一步實驗驗證與支持，使理論更加可靠。