FDPS、LRP5基因多態性與絕經后婦女骨質疏松的關系

劉百奇 車德馨 侯慶露 韓健 潘華興 徐東輝

齊齊哈爾市第一醫院骨外科，黑龍江 齊齊哈爾 161005

絕經后骨質疏松癥( postmenopausal osteoporosis，PMOP) 是絕經后婦科臨床上較常見的骨科疾病，主要臨床癥狀為腰背部酸痛、身長縮短以及股骨頸、脊椎等脆性骨折等[1]。骨質疏松癥(osteoporosis，OP)和骨折易感性是多因素的，主要受環境因素和遺傳因素的影響，據統計60 %至80 %的骨質流失加速是由遺傳因素造成的[2]。由于OP是一種多基因疾病，每種骨骼表型(密度、質量、代謝率)都是由多基因相互作用的結果，盡管采用了各種先進的方法，但導致OP的關鍵基因尚未被確定[3]。

Wnt是骨骼中最重要的信號通路之一，在胚胎發育過程中對骨發育至關重要，在骨量調節中具有雙重作用，是蛋白質參與影響骨形成和骨吸收[4]。低密度脂蛋白受體相關蛋白5(LRP5)是Wnt信號通路中最重要的膜受體，它曾在全基因組關聯研究中(GWAS)被標記為與OP相關[5]。LRP5基因突變引起的失活導致骨質疏松-假性神經膠質瘤綜合征，從而出現骨量降低和骨折的發生[6]。此外，還有幾種自然產生的Wnt信號抑制因子，如基因重組蛋白(DKK)和硬化蛋白(SOST)，可以使LRP5受體的信號失活，通過與LRP5協同受體結合，拮抗成骨細胞中的Wnt信號傳導，阻止骨形成[7]。在絕經后OP治療中，法尼酰二磷酸合酶(FDPS)是甲羥戊酸途徑關鍵酶，作為氨基雙膦酸鹽類抗再吸收藥物作用靶點，維持著破骨細胞的活性，可能影響未接受治療的婦女的骨量，改變破骨細胞的活性，促進骨密度和骨周轉率[8]。

OP的發病機制是由調控骨骼和礦物質代謝的各種遺傳因素與跌倒風險因素、環境影響和生活方式等因素的相互作用的結果[9]。本研究的目的是評估絕經后婦女中，已被驗證了的二個候選骨質疏松癥基因(FDPS rs2297480, LRP5 rs3736228)的基因型和BMD之間的關系及與骨質疏松的相關性。

1 材料和方法

1.1 一般資料

納入2017年6月至2019年8月期間，在我院就診的364名絕經后婦女，平均年齡64.9±8.3歲。納入標準為：年齡>45歲，絕經>2年，近期診斷骨質疏松癥或采用雙能X線骨密度儀(DXA)測量骨密度(BMD)正常的婦女。將其分為兩組：骨質疏松癥組(228人)和BMD正常者為對照組(136人)。排除標準：有代謝性骨病病史(如甲狀旁腺功能亢進、骨軟化、Paget病等)、惡性腫瘤、骨轉移病史以及使用影響骨代謝藥物(如抗骨質疏松藥物、維生素K拮抗劑)治療的患者。臨床資料收集，包括年齡、體質指數(BMI)、絕經年齡及時間、腰椎(L1-4)、股骨頸、髖部總骨密度和骨質疏松性骨折風險(FRAX)。此外，從每個研究參與者身上采集2 mL血液，用 EDTA真空抗凝管留取，用于基因檢測。該研究通過醫院倫理委員會批準(2017026)，所有參與者都簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1BMD測定：所有研究對象采用雙能X線骨密度儀完成(單位g/cm2)，測量部位包括腰椎(L1-4)、股骨頸及全髓。由放射科專門測定BMD的技術人員協助完成。本研究中BMD的測定分別采用Lunar及Hologic兩種儀器完成。對于絕經后女性骨質疏松癥診斷標準，基于測定股骨頸、腰椎BMD的T值低于同性別、同種族健康成人的骨峰值2.5個標準差為骨質疏松，即T≤-2.5為骨質疏松。二種儀器間的系統誤差采用線性回歸方程進行數據換算：Hologic BMD值(g/cm2)=0.802×Lunar值+0.318(R=0.991；P<0.001)。

1.2.2SNP基因分型：基因組DNA從EDTA抗凝管提取的外周血中提取，采用天根北京生物科技公司血基因組提取試劑盒。然后進行DNA濃度測定。利用PCR-RELP法對FDPS rs2297480進行基因分型。利用Tapman熒光探針法對LRP5 rs3736228進行基因分型。所有步驟均按廠家說明進行。反應混合物中含有10 μL的2×TaqMan基因分型主混合物(Thermo Fisher公司，美國)，0.5，μL匹配40×TaqMan SNP基因分型檢測，約25，ng基因組的DNA和游離核酸酶混合物，最終體積為20 μL。所有基因分型均采用相同的擴增程序，在60 ℃進行30 s預讀，在95 ℃保持10 min，然后進行PCR，共40個循環，每個循環95 ℃ 15 s和60 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s擴增后讀數。PCR自動循環儀器 (Bio-Rad公司, 美國)。

1.3 統計學處理

2 結果

共有364名患者符合納入標準，其中228名診斷為OP，另136名BMD正常。臨床一般資料骨質疏松組與對照組相比，年齡偏大，體質指數更小，絕經年齡更小，閉經年限更長，L1-4、股骨頸及髖關節BMD更低，骨折風險更高(P<0.05)。納入研究女性的主要特征見表1。

表1 納入研究的婦女的臨床特征

FDPS rs2297480、LRP5 rs3736228基因型及等位基因在研究群體(n=364)中的分布頻率見表2。

表2 研究人群中SNP的等位基因和基因型頻率[n=364,n(%)]

攜帶FDPS rs2297480 TT基因型者在腰椎和全髖部的BMD值顯著低于雜合子GT和純合子GG (P=0.006和P=0.03)，在股骨頸的BMD值下降不顯著(P=0.179)。至于LRP5 rs3736228純合子CC 在股骨頸和全髖的BMD值明顯低于CT或TT基因型(P=0.028，P=0.014)，但在腰椎BMD變化不顯著(P=0.717)，見表3。

表3 不同基因型間的骨密度值[n=364，g/cm2, M(P25～P75)]Table 3 BMD values between different genotypes [n=364，g/cm2, M(P25～P75)]

在共顯性模型分析中，rs2297480 SNP的TT基因型發生OP風險最高(OR=2.1；95 %CI：1.4～3.3；P<0.05，雜合子GT基因型風險最低(OR=0.4；95 %CI：0.3～0.7；P=0.001)。T等位基因的存在與OP發生顯著相關(P=0.005)。rs3736228 SNP的CC基因型發生OP風險最高(OR= 1.5；95 %CI：0.9～2.4；P=0.05)，雜合子CT風險最低(OR=0.6；95 %CI：0.3～0.9；P=0.041)。C等位基因與OP沒有發現關聯(P=0.143)，見表4。

表4 骨質疏松癥組與對照組之間的等位基因和基因型分布及相關性[n(%)]Table 4 Allele and genotype distribution and correlation between the osteoporosis group and the control group[n(%)]

3 討論

目前60歲以上人群中骨質疏松癥的患病率有增高趨勢,尤其是絕經后婦女[10]。盡管過去在確定涉及BMD、骨折和其他相關表型的候選基因方面已經有了顯著的進展，但大多數的遺傳變異仍未被發現或驗證。研究者一直在尋找遺傳因素在骨量丟失發病機制中的作用，但迄今為止，在這一領域還沒有關于OP的決定性病因信息。目前已被證實在單核苷酸多態性(SNPs)中多個基因與BMD有關，但是結果不確定或相互矛盾。全基因組關聯研究(GWAS)中研究了60 多個與BMD 相關基因，證實了BMD 基因的多態性，BMD在母親與女兒之間存在高度相關性，主要是由于骨表型的遺傳因素決定了骨質疏松癥的發生[11]。

LRP5基因作為Wnt 信號傳導通路的受體，其基因的多態性與骨代謝之間的關系越來越受到重視[12]。LRP5是一種跨膜受體蛋白，屬于低密度脂蛋白受體家族之一，它的編碼基因定位于染色體11q12-13上，是Wnt 配體的輔助受體[13]。有研究表明給予去卵巢的小鼠雌激素處理，其LRP5 的表達明顯升高，骨密度增加[14]。LRP5是一種跨膜受體，它允許外源性的化學信號傳遞到細胞核內參與骨的形成。LRP5是Wnt蛋白的輔助受體，骨形態發生蛋白(BMP)2誘導的堿性磷酸酶激活依賴于LRP5/Wnt信號通路。LRP5基因突變，尤其是171 位甘氨酸突變所引起的LRP5失活是骨質疏松癥-假性膠質瘤綜合征的發病原因，其特點是低骨量和骨折[15]。一些常見的LRP5基因多態性已被檢測出與骨骼表型相關，包括骨折風險和骨密度，其中LRP5基因的編碼單核苷酸多態性(SNP) rs3736228 (A1330V)被認為對骨質疏松具有特殊的易感性[16]。另外研究揭示了FDPS在維持破骨細胞吸收活性方面的重要作用，FDPS酶的基因多態性與絕經后婦女骨密度的有關，FDPS酶也是氨基膦酸鹽的主要靶點。一些研究檢測了人類FDPS基因中已驗證的常見多態性dbSNP：rs2297480也與絕經后婦女骨量有關[17]。Olmos等[18]研究顯示SNP rs2297480與65歲以上絕經后婦女的骨密度之間的顯著相關性。

我們的研究表明，FDPS rs2297480點位的主要等位基因T的存在與骨質疏松癥之間存在顯著相關性(P=0.005)。rs2297480點位基因型TT顯著降低腰椎BMD值和全髖關節BMD值(P<0.05)。這些結果與Levy等[19]的研究結果一致，他們同樣評估了FDPS的多態性，還發現在老年婦女中主要的等位基因C的存在與低BMD之間有很強的相關性。相反Massart等[20]評估了女性rs2297480多態性基因型與骨密度的關系，但未發現與基線BMD的相關性。Canto-Cetina等[21]發現，LRP5 rs3736228多態性與女性所有BMD位點變異之間存在顯著相關性。而Falcn-Ramírez等[22]在他們的研究群體中沒有發現相同位點基因型與BMD的顯著關聯。在我們的研究中LRP5 rs3736228位點CC和CT基因型與OP相關(P=0.05和P=0.041)。此外，攜帶CC基因型的絕經后婦女股骨頸和全髖關節骨密度顯著降低(P<0.05)。在某些種族人群中，所有BMD位點中LRP5 rs3736228 CC基因型的BMD值往往高于TT基因型[20]。Markatseli等[23]在圍絕經期和絕經后婦女隊列中報道，CT/TT基因型的存在與腰椎骨密度一致。Ezura等[24]分析了rs3736228基因型與成年女性骨密度的關系，他們發現攜帶小T等位基因的純合子BMD得分最低，攜帶大C等位基因的純合子BMD得分較高。這些結果與本研究的基因型分布相似。但我們的研究結果表明，骨質疏松風險基因型可能與絕經后女性的rs3736228基因型純合子CC有關。存在的這些差異可能跟不同地區、不同種族有關。

綜上所述，我們的研究得出在絕經后的骨質疏松癥婦女中，BMD和FDPS基因多態性之間有很強的相關性，與LRP5基因多態性之間存在較低關聯。本研究存在幾個局限性，首先，本研究只包括本地區女性，目前還不清楚該結果是否可以推斷出不同種族的女性。其次，樣本數較小，因為遺傳研究需要更多的受試者來實現足夠的統計效力。第三，研究設計是基于臨床和志愿者，而不是基于人群，因此潛在的偏差仍然存在。這些需要在今后的工作中進一步驗證，使其更具科學性和實用性。