海南黑山羊GDF9和BMP15基因多態性與初胎產羔數間的關系

晁哲，邢漫萍，黃麗麗，孫瑞萍，劉海隆，魏立民，劉圈煒，鄭心力

(海南省農業科學院畜牧獸醫研究所,海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點實驗室,海南 海口 571100)

海南黑山羊是海南省唯一的地方山羊品種，在《中國畜禽遺傳資源志(羊志)》中，海南黑山羊被歸類為雷州山羊。海南黑山羊具有肉質好、耐高溫高濕、耐粗飼、合群性強等特點，其作為重要的產肉動物和地方品種資源，在生產和科研上都具有重要價值[1]。近年來，海南黑山羊的市場需求量逐年增加，但其供給嚴重不足，導致此種現象的原因之一就是海南黑山羊繁殖性能較差、產羔數少且不穩定。因此，在常規雜交改良的同時，通過分子遺傳學方法對海南黑山羊繁殖性能進行研究，鑒定與海南黑山羊產羔數相關的候選基因，篩選可用的分子標記進行輔助育種，有助于提高海南黑山羊的繁殖效率，增加其養殖的經濟效益。

生長分化因子9(growth differentiation factor 9, GDF9)和骨形態發生蛋白15(bone morphogenetic protein 15, BMP15)對哺乳動物卵泡正常的生長和分化具有重要的調節功能，被認為是影響畜禽繁殖性能的主要候選基因[2-3]。在綿羊和山羊中，GDF9和BMP15基因作為控制產羔數的重要候選基因被廣泛研究，與之相關的SNP位點不斷被發現，并在不同品種的綿羊和山羊群體中被驗證[4-6]。其中，GDF9基因中存在一個重要的SNP，位于該基因編碼區260 bp處的A/G突變，該突變屬于錯義突變，導致第87個氨基酸由組氨酸變為精氨酸[7-8]；BMP15基因同樣存在一個錯義突變，位于該基因編碼區805 bp處的C/G突變，該突變引起第269個氨基酸由精氨酸變為甘氨酸[9]。目前，關于海南黑山羊GDF9基因和BMP15基因與產羔數間的關系研究尚未見報道。本研究通過PCR產物測序獲得海南黑山羊GDF9基因和BMP15基因序列信息，鑒定基因中的SNP位點，分析基因多態性與海南黑山羊初胎產羔數間的關系，為海南黑山羊資源保護與開發利用提供科學數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在海南澄邁福羊牧業有限公司采集70只海南黑山羊母羊耳組織樣品，在海南開泰東山羊產業有限公司采集86只海南黑山羊母羊耳組織樣品。耳組織樣品采集后立即放入冰盒，送回實驗室后放置在-20 ℃冰箱，用于提取基因組DNA。在采集耳組織樣品的156只海南黑山羊母羊中，統計出139只母羊的初胎產羔數。

1.2 主要試劑

2×TaqMaster Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；D2000 DNA Marker購自北京天根生化科技有限公司；Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；其他化學試劑如無水乙醇等，均為國產分析純產品。

1.3 基因組DNA的提取

使用基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，用滅菌后的去離子水溶解，取部分DNA樣品稀釋至100 ng/μL，-20 ℃保存備用。

1.4 引物設計與合成

根據NCBI中提供的山羊GDF9和BMP15基因序列(基因ID依次為：100860859和100861233)，使用Primer Premier 5.0軟件設計2個基因的擴增引物，通過序列比對尋找基因中的SNP位點。以上引物序列信息詳見表1和表2。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 擴增山羊GDF9基因所用引物序列及特征

表2 擴增山羊BMP15基因所用引物序列及特征

1.5 PCR擴增、測序及序列比對

25 μL PCR反應體系：樣品DNA(100 ng/μL)1 μL，2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，去離子水9.5 μL。PCR擴增條件為：94 ℃預熱4 min；94 ℃變性45 s，退火45 s(每對引物的退火溫度見表1和表2)，72 ℃延伸50～80 s(由片段長度決定)，35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖電泳檢測合格后，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。序列比對分析使用在線軟件Multiple Sequence Alignment(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/)完成。

1.6 多態性檢測

使用GD1-F/GD1-R引物檢測GDF9基因+183處的A/C突變和+260處的A/G突變，G3F/G3R引物檢測GDF9基因+2 082處的A/C突變和+2 541處的C/T突變。使用B1F/B1R引物檢測BMP15基因-519處的A/G突變，BMP15-1F/BMP15-1R引物檢測BMP15基因+6 048處的A/G突變、+6 121處的C/G突變和+6 124處的C/G突變。PCR反應體系、擴增條件均與1.5中的描述相同。PCR產物測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，通過測序峰圖判定基因型，單峰表示純合子，雙峰表示雜合子。

1.7 統計分析

建立單標記回歸統計模型，利用SAS統計軟件(SAS Institute Inc,Version 8 Edition)GLM程序進行單標記方差分析，同時采用REG程序計算基因加性效應和顯性效應，并進行顯著性檢驗。模型為：Yijk=μ+Gi+Sj+Fk+eijk，模型中Yijk是性狀表型值，μ是均值，Gi是基因型效應(包括加性效應和顯性效應)，Sj、Fk是固定效應，分別是胎次(初產是0，經產是1)、場區效應(海南澄邁福羊牧業有限公司是0，海南開泰東山羊產業有限公司是1)，eijk是殘差。

2 結果

2.1 GDF9基因PCR擴增與序列分析

使用3對引物擴增海南黑山羊GDF9基因，分別得到長度為761、796和871 bp的DNA序列，見圖1。

M.D2000 DNA Marker;1. G1F/G1R引物擴增片段;2. G2F/G2R引物擴增片段;3. G3F/G3R引物擴增片段

通過比對10頭海南黑山羊GDF9基因的3個擴增片段序列，共發現3處堿基突變，見表3。這3處堿基突變分別位于GDF9基因的第1外顯子、第2外顯子和3′端。

表3 海南黑山羊GDF9基因序列比對結果

2.2 BMP15基因PCR擴增與序列分析

使用3對引物擴增海南黑山羊BMP15基因，分別得到長度為835、859和975 bp的DNA序列，見圖2。

M.D2000 DNA Marker;1. B1F/B1R引物擴增片段;2. B2F/B2R引物擴增片段;3. B3F/B3R引物擴增片段

通過比對10頭海南黑山羊BMP15基因的3個擴增片段序列，共發現2處堿基突變，見表4。這2個堿基突變分別位于BMP15基因的5′端和第2外顯子。

表4 海南黑山羊BMP15基因序列比對結果

2.3 GDF9和BMP15基因多態性分析

在GDF9基因中，位于+183處的A/C突變(圖3)在海南黑山羊群體的優勢基因型為CC，A和C兩個等位基因頻率分別是0.23和0.77；位于+2 082處的A/C突變(圖4)在海南黑山羊群體的優勢基因型為AA，A和C 2個等位基因頻率分別是0.86和0.14；位于+2 541處的C/T突變(圖5)，C等位基因和T等位基因在海南黑山羊群體中的基因頻率分別是0.42和0.58(表5)。

1. AA基因型;2. AC基因型;3. CC基因型

1. AA基因型;2. AC基因型;3. CC基因型

在BMP15基因中，位于-519處的A/G突變(圖6)在海南黑山羊群體內呈多態性分布，A等位基因和G等位基因頻率分別是0.51和0.49；位于+6 124處的C/G突變(圖7)在海南黑山羊群體內呈偏態分布，CC基因型是優勢基因型，C等位基因頻率達到0.96(表5)。

表5 GDF9和BMP15基因在海南黑山羊中的多態性分布

1. AA基因型;2. AG基因型;3. GG基因型

1. CC基因型;2. CG基因型

2.4 基因多態性與初胎產羔數的關聯分析

根據統計的139只海南黑山羊母羊初胎產羔數，使用SAS統計軟件研究了GDF9基因+183處的A/C突變、+2 082處的A/C突變、+2 541處的C/T突變，BMP15基因-519處的A/G突變與產羔數間的聯系。結果顯示，只有GDF9基因+2 541處的C/T突變與初胎產羔數呈顯著相關(表6)，TT基因型個體的產羔數顯著高于CC基因型個體(P<0.05)，且加性效應極顯著(P<0.01)。

表6 GDF9和BMP15基因多態性與初胎產羔數間的關聯分析

3 討論

GDF9屬于轉化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)超家族的成員，該基因家族對細胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調節作用[10]，在胚胎發生、器官發育、腫瘤發生等多種生物過程中扮演重要角色[11-12]。哺乳動物的GDF9和GDF3在1993年被發現，GDF3主要在成年人的骨髓、脾臟、胸腺和脂肪組織中表達，而GDF9僅在卵巢中表達[13]。BMP15又稱生長分化因子9B(growth differentiating factor 9B, GDF9B)，它也是TGF-β超家族的成員之一，與GDF9結構同源且功能類似[14]。BMP15最早是在人、嚙齒動物和綿羊的卵母細胞中被發現，其主要生理功能是調控動物卵泡的發育過程，促進卵母細胞成熟和排卵[15]。

提高羊群產羔數一直都是畜牧育種工作的重點和難點。GDF9和BMP15作為能夠有效增加排卵數和產羔數的重要候選基因，研究者首先在綿羊中進行了廣泛的多態性檢測和性狀關聯分析。在Cambridge和Belclare綿羊群體中，Hanrahan等[7]發現GDF9基因序列中存在8個SNP位點，依次命名為G1～G8，其中G1、G4、G6、G7、G8突變引起編碼氨基酸的改變；同時發現BMP15基因中存在4個突變位點，分別命令為B1～B4，其中B1屬于堿基(CTT)缺失，B2、B3和B4屬于單堿基突變。隨后，在伊朗的Moghani和Ghezel綿羊[16]、印度的Garole綿羊[17]等群體中，均檢測到GDF9和BMP15基因突變位點的存在。GDF9基因中的G1是指編碼區260 bp處的A/G突變位點，國內飼養的主要綿羊品種如湖羊、小尾寒羊、杜泊羊、洼地綿羊等，在該位點都存在2種基因型(GG和AG)，國內山羊地方品種如貴州白山羊、濟寧青山羊和遼寧絨山羊，在該位點以GG基因型為主，伴有少量的AG基因型，內蒙古絨山羊則只檢測到GG基因型[18]。本試驗群體中只有GG基因型，說明在海南黑山羊中可能不存在G1突變位點。同樣，在BMP15基因中已報道的+6 048處的A/G突變和+6 121處的C/G突變在海南黑山羊群體中也不存在。本研究在海南黑山羊GDF9和BMP15基因中共發現5處堿基突變，基因多態性位點少于其它綿羊和山羊品種，主要原因是海南黑山羊長期飼養在海南島，環境相對封閉，造成基因純和度較高。此外，5處堿基突變中有2處是首次發現，分別是GDF9基因中+2 541處的C/T突變和BMP15基因中-519處的A/G突變，這說明海南黑山羊具有獨特的種質特性。

除了通過單基因標記關聯分析發現GDF9和BMP15基因對綿羊產羔數有影響外[19-20]，借助全基因組關聯分析技術，研究者在法國Grivette綿羊和波蘭Olkuska綿羊群體中檢測到BMP15基因與產羔數呈顯著相關[21]，在挪威白色綿羊群體中發現GDF9基因與產羔數呈顯著相關[22]。山羊和綿羊屬于同科但不同屬的動物，雖然有很多相似之處，但在生物學和生理學上差異較大，例如山羊有30對染色體，而綿羊只有27對染色體。對綿羊產羔數有影響的GDF9和BMP15基因，在山羊不同品種中是否有效，研究者做了大量的驗證工作。在濟寧青山羊中，我國學者發現GDF9基因中有4個SNP位點，分別位于第1內含子和第2外顯子中，其中第2外顯子中的1個A/C突變位點與產羔數相關，該位點CC基因型和AC基因型個體的產羔數顯著高于AA基因型個體[23]。但與此相反，伊朗的研究者在Markhoz山羊中，也發現GDF9基因中存在4個SNP位點，但這4個位點對產羔數都沒有顯著性影響[24]。BMP15基因不同基因型在貴州黑山羊群體中對產羔數有顯著影響，但在酉州烏羊、印度本地黑山羊中則表現為差異不顯著[25-26]。由此可見，在不同山羊品種中，因遺傳背景的差異導致GDF9和BMP15基因多態性與產羔數間的連鎖關系不同。在海南黑山羊群體中，GDF9基因+2 541處的C/T突變與初胎產羔數有緊密的連鎖關系，我們將繼續收集海南黑山羊不同胎次的產羔數，針對該突變位點進一步研究GDF9基因多態性對海南黑山羊產羔數的影響。

目前，通過全基因組關聯分析的方法，在云南黑山羊群體中已鑒定出2個影響產羔性狀的重要候選基因，分別是溶質載體家族4成員10(solute carrier family 4 member 10, SLC4A10)和T-box轉錄因子(T-box brain transcription factor, TBR1)[27]。海南黑山羊和云南黑山羊同屬中國南方山羊品種，下一步我們將在海南黑山羊群體中驗證SLC4A10和TBR1對產羔數的影響，期待發現更多的有助于提高海南黑山羊產羔數的基因標記。

4 結論

在海南黑山羊群體中，GDF9基因存在3處堿基突變，分別位于GDF9基因的第1外顯子、第2外顯子和3′端，BMP15基因存在2處堿基突變，分別位于BMP15基因的5′端和第2外顯子；GDF9基因+2 541處的C/T突變與初胎產羔數呈顯著相關，TT基因型個體的產羔數顯著高于CC基因型個體。該研究結果為海南黑山羊繁殖性狀的選育提供可用的分子標記。