佛耳草總黃酮的提取工藝優化與含量測定方法研究

陳巍，張樂，何達，閆娜

(1. 江蘇農牧科技職業學院動物藥學院，江蘇 泰州 225300；2. 博瑞生物醫藥(蘇州)股份有限公司，江蘇 蘇州 215123)

佛耳草又名清明草、鼠麹(曲)草、黃花菊草，為菊科植物鼠麹草Laphangiumaffine(D.Don)草本植物，在我國華東、華中、西南及河北、陜西、臺灣等地均有大量分布[1]，生于低海拔干地或濕潤草地，是一種藥食同源植物，還可用作食品、化妝品的添加劑[2]。作為食品原料已開發出糕點、果蔬飲料、保健茶、保健米酒[3]等。同時，佛耳草也是一種重要的中草藥，《中國藥典》1977 年版曾收載本品[4]，后收載于1989年版和2016年版(最新版)的《江蘇省中藥材標準》[1,5]。

佛耳草在民間多加水煎服治療咳嗽、慢性氣管炎，用水和酒合煎治療風濕筋骨痛和跌打傷痛。著名中醫學家，原中央衛生部金質獎章獲得者姜春華教授治療哮喘的經驗方“截喘湯”(佛耳草湯)以佛耳草為主藥，在治療由哮喘、慢性支氣管炎、肺氣腫引起的咳嗽痰多、氣逆喘促等癥狀方面具有顯著的效果[6]。上海市中醫醫院使用院內制劑“復方佛耳草合劑”，聯合常規西藥對慢性阻塞性肺疾病患者治療，可顯著緩解患者咳嗽、咯痰癥狀，改善患者肺通氣指標，降低炎癥因子水平[7-8]。廣東省梅縣中醫院使用“佛耳合劑”治療肺炎、氣管炎、支氣管哮喘也取得較好臨床效果[9]。

佛耳草主要含黃酮苷、揮發油、氨基酸，以及 Ca、Cu、K 等礦物質營養元素[10]，具有抗菌抗病毒、鎮咳祛痰活性，還可以保護肝臟、美容駐顏、殺蟲等作用，其中槲皮素等黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、抑菌作用[11-14]。

目前對佛耳草總黃酮的提取工藝研究較少，質量研究方面僅有對槲皮素、芹菜素、木犀草素等單黃酮成分的HPLC測定報道[15-17]。考慮到以某一種成分為其含量測定指標，有一定的片面性和局限性，不便全面了解藥材的整體質量。本試驗以佛耳草提取物干浸膏得率和總黃酮含量為考察指標，采用正交試驗法對提取工藝進行了優選，開發了總黃酮成分的測定方法，為進一步開發利用該藥材提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材與試劑

佛耳草藥材于2019年5至6月采于江蘇鎮江、揚州兩地，除去雜質，經水洗后切成小段，干燥備用。

槲皮素(C15H10O7)對照品(批號：100081-201610)購于中檢院；甲醇(色譜純)購于Merck公司；冰醋酸(分析純)購自于國藥上海化學試劑公司；分析用水為超純水。

1.1.2 試驗儀器

UV-1800紫外-可見分光光度計(日本島津)；AUW220電子分析天平(日本島津)； XM50鹵素快速水分測定儀(瑞士普利賽斯)；YRE-501旋轉蒸發儀(鞏義予華)；HH-8數顯恒溫水浴鍋(常州國華)。

1.2 方法

1.2.1 總黃酮標準曲線的繪制

取槲皮素對照品約10 mg，精密稱定，用80%甲醇定容至10 mL容量瓶中，搖勻，作為對照品儲備液。

精密量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置25 mL容量瓶中，80%甲醇定容至刻度。分別精密量取5.0 mL，加入20%(V/V)鹽酸5.0 mL，室溫振搖5 min水解，60℃水浴蒸干，用80%甲醇轉移殘渣至50 mL容量瓶中，并稀釋定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過。以相應試劑作為空白校正，照紫外-可見分光光度法在360 nm處測定吸光度。

1.2.2 藥材提取

精確稱取干燥藥材100 g，用適量的不同濃度乙醇，按擬定溫度、時間進行回流提取，合并提取液，過濾，減壓濃縮至1 000 mL，得到藥材提取液，冷卻至室溫，備用。

1.2.3 浸膏得率的測定

精密量取藥材提取液50 mL，按中國藥典2020版一部(附錄XA)浸出物測定法[18]水浴蒸干，105 ℃干燥3.0 h，置干燥器中冷卻0.5 h，精密稱定重量，按下式計算浸膏得率。

浸膏得率=[W×V/(M×50)]×100%；其中W代表浸膏重量，V代表各樣品液總體積，M代表藥材重量。

1.2.4 總黃酮的測定

精密量取5.0 mL樣品提取液，按1.2.1項下的方法自“加入20%(V/V)鹽酸5.0 mL”起操作，測定吸光度，根據標準曲線計算即得。

1.2.5 單因素試驗

乙醇濃度考察：精密稱取10 g干燥藥材，置500 mL磨口錐形瓶(帶冷凝管)，按藥材質量的20倍體積數(mL)分別加入45%、60%、75%的乙醇，在水浴上連續提取2.0 h，過濾，再濃縮至100 mL，冷卻至室溫，照1.2.4項下方法測定總黃酮含量，比較不同濃度乙醇對總黃酮含量和浸膏得率的影響。

溶媒體積考察：精密稱取10 g干燥藥材，分別按藥材質量的10、15和20倍體積數(mL)加入60%的乙醇，在水浴上提取2.0 h，方法同上，比較提取溶媒體積對提取率的影響。

提取時間考察：精密稱取10 g干燥藥材，按藥材質量的20倍體積數(mL)各加入60%的乙醇，在水浴上分別提取1.0、2.0和3.0 h，方法同上，比較提取時間對提取率的影響。

提取次數考察：精密稱取10 g干燥藥材，按藥材質量的20倍體積數(mL)加入60%的乙醇，在水浴上分別提取1次、2次、3次，每次提取后更換新的溶媒，合并提取液，方法同上，比較提取次數對提取率的影響。

1.2.6 正交試驗設計

為綜合評估乙醇濃度、溶媒體積、提取時間、提取次數4個因素對浸膏得率和總黃酮類指標成分含量的影響，按照正交表L9(34)設計試驗，每個因素進行3個水平的考察。具體提取工藝因素水平見表1。

表1 提取工藝因素水平表

2 結果與分析

2.1 總黃酮含量測定方法學研究

2.1.1 專屬性試驗

取1.2.1項和1.2.4項下空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液，置1 cm石英比色皿中，分別進行200～600 nm波長范圍內掃描，發現空白溶劑無吸收干擾，槲皮素對照品和供試品溶液在360 nm附近有明顯紫外吸收峰，且峰形平緩，故選擇接近可見光區的360 nm的測定波長，方法專屬性較好。

2.1.2 標準曲線

以吸光度(A)為縱坐標，以對照品溶液濃度X(mg/mL)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程為：A=9.812 4X+0.002 2，R2=0.998 9，說明總黃酮含量在濃度0.008 71～0.043 4 mg/mL范圍內與其吸光度有良好的線性關系。標準曲線見圖1。

圖1 總黃酮標準曲線

2.1.3 重現性試驗

分別精密量取0.6 mL槲皮素對照品儲備液5份，按 1.2.1項下操作連續測定5次，結果見表2，說明本方法操作重現性較好。

表2 重現性試驗結果(n=5)

2.1.4 重復性試驗

取表2中樣品1，重復測定6次，結果見表3，說明本方法操作重復性較好。

表3 重復性試驗結果(n=6)

2.1.5 中間精密度試驗

更換檢測日期和操作人員，以及采用不同檢測儀器(島津UV-2600)，精密量取0.8 mL槲皮素對照品儲備液，按 1.2.1項下操作平行測定5次，結果見表4。

表4 中間精密度試驗結果(n=5)

結果表明，不同時間、不同分析人員、不同設備對測定結果影響較小，說明本方法中間精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗

按1.2.2和1.2.4項下方法，取3號正交試驗樣品提取液制備供試品溶液，分別于0、0.5、1、2和4 h測定吸光度，結果見表5。

表5 穩定性試驗結果(n=5)

結果表明，供試品溶液在4 h內基本穩定。取吸光度平均值代入標準曲線方程，求得供試品溶液濃度為0.024 9 mg/mL。

2.1.7 準確度試驗

分別精密量取2.0、2.5、3.0 mL上述已測含量的3號提取液，用移液槍分別定量加入450、580和700 μL的1.085 mg/mL的槲皮素對照品儲備液，按1.2.4項操作制備相當于含槲皮素80%、100%、120% 3個濃度水平的供試品溶液，同法測定紫外吸光度，代入標準曲線方程求得總黃酮含量，按下式計算加標回收率，結果見表6。

表6 加標回收率測定結果(n=9)

加標回收率=(M2-M1)/M0×100%，其中M2代表測得量，M1代表對照品加入量，M0代表各樣品原有含量。

由結果可見，9份樣品加標回收率較高，平均回收率接近100%，且相對標準偏差較小，說明供試品制備方法穩定，操作易重現，分析方法準確度較高。

2.1.8 檢測限

采用水代替供試樣品(即1.2.1項下空白溶液)，平行測定6次，根據下式計算方法檢測限為0.56 μg/mL。

LOD(檢測限)=3×d/標準曲線斜率，d為6次空白溶液的標準偏差。

2.2 單因素試驗

以總黃酮含量和浸膏得率為指標，考察單因素對提取率的影響，結果：隨著乙醇濃度增加，總黃酮含量不斷提高，但浸膏得率為先升后降，分析原因是高濃度乙醇，能更多提取中、低極性的黃酮類成分，但同時影響了水溶性等高極性成分的提取；提取溶媒用量從10倍增加到15倍，提取率有小幅增加，總黃酮的增幅大于浸膏得率，但增加至20倍無明顯變化；總黃酮含量隨著累積提取時間的延長總體趨勢是先上升，至4 h時趨于穩定，但在6 h時出現小幅下降，這可能是由于有些黃酮類化合物難以提取，所需時間較長，又因部分黃酮類物質熱穩定性差，長時間高溫導致其破壞所致。

2.3 正交試驗

按L9(34)正交表完成試驗，并將浸膏得率和總黃酮含量結果進行統計和方差分析，結果分別見表7和表8。

表7 正交試驗結果

表8 方差分析結果

表7極差值大小顯示：各因素對浸膏得率和總黃酮含量影響次序均為A(乙醇濃度)> B(溶媒體積)> D(提取次數)> C(提取時間)。結合各因素不同水平的影響，以浸膏得率為考察指標，A1B3C3D2為最佳提取工藝條件；以總黃酮為考察指標，A3B3C3D2為最佳提取工藝條件。

表8進一步分析了影響提取的顯著性影響因素，可以發現乙醇濃度的影響非常顯著(P<0.01)，溶媒體積較為顯著(P<0.05)，其他因素無顯著影響。

考慮到以不同的指標考察最佳提取工藝時，優化所得工藝條件中不同的只是因素A的水平，即乙醇濃度的不同。從表5的結果直觀分析，發現：(1)隨著乙醇濃度的升高，浸膏得率反倒有所下降，特別是當乙醇濃度超過60%后，下降較多，數值基本在15.3%～20.1%之間變化，這說明提取濃度對有效成分的浸出并不呈正比關系。相反，乙醇濃度越小，對藥材細胞壁滲透越完全，所以多糖、黏液質、色素等水溶性成分提取會更多，造成浸膏較高濃度醇提時的得率要高。(2)乙醇濃度越高，總黃酮的含量越高，這與黃酮苷在中濃度乙醇極性溶劑中有較高的溶解度相關。其中，乙醇濃度對從45%變化到60%，總黃酮含量變化幅度遠高于從60%變化到75%，即(K2-K1)>(K3-K2)。因此，從大生產節約成本和提高安全性方面考慮，兼顧到浸膏得率和總黃酮的收率，選擇60%的乙醇為提取溶劑。

綜上，確定佛耳草最佳提取工藝條件為A2B3C3D2，即采用20倍干藥材重量的60%乙醇回流提取2次，每次2 h。

2.4 工藝驗證試驗

稱取佛耳草粗粉200 g，共3份，按上述最佳工藝條件重復試驗3次，結果批間差異較小。浸膏平均得率為26.80%，明顯高于表7的試驗平均值22.20%；總黃酮含量為0.324 mg/mL，僅次于試驗的最高值0.332 mg/mL。說明優化后的提取工藝穩定，放大可行性較好。

3 討論

正交試驗工藝優化前，曾對常用的提取用純化水和乙醇液作過預試驗考察，發現佛耳草采用含乙醇溶媒提取，浸膏收率和總黃酮含量都明顯優于水提效果。這是因為佛耳草中有效成分黃酮苷在乙醇中有較好的溶解度，考慮乙醇還有毒性小、易于回收、可重復利用，且提取物不容易霉變的優點，因此選用乙醇作為提取溶媒。

佛耳草中所含的槲皮素、木犀草素、芹菜素等黃酮類成分均以苷的形式存在，有類似的生理活性，故選擇以總黃酮的含量作為醇提取物的指標成分。通過采用酸水解方式將提取物中黃酮類成分轉化成黃酮苷元，再采用方便、快速的紫外-可見分光光度法測定。樣品前處理曾考察過20%(V/V)稀鹽酸不同用量對黃酮苷的提取轉化率的影響，結果發現供試液使用5.0 mL稀鹽酸，室溫振搖5 min后，樣品的吸光度值最高且基本穩定，繼續增加鹽酸用量，樣品吸光度反而下降，分析原因是過量酸對黃酮成分產生破壞降解，故選擇20%(V/V)鹽酸5.0 mL，室溫振搖5 min測定為宜。

4 結論

我國佛耳草資源豐富，分布廣泛，具有多種藥理活性，可藥食兩用，是一種極具開發利用潛力的生物資源。本研究在單因素考察基礎上，確認了乙醇濃度、溶媒倍數、提取時間、提取次數為影響佛耳草提取率的主要因素，后經過正交試驗篩選和驗證，開發了一個科學、合理的優化提取工藝。同時，建立了總黃酮和浸膏得率的測定方法，為佛耳草的進一步研究和充分利用提供參考。