偽狂犬病病毒變異株UL3、UL46和UL50基因失活株的構建與生物學特性分析

殷涵臻，張傳健，曾榮愚，費榮梅，王繼春

(1. 南京農業大學動物醫學院，江蘇 南京 210095；2. 江蘇省農業科學院動物免疫工程研究所，江蘇 南京 210014；3. 江蘇省農業科學院國家獸用生物制品工程技術研究中心，江蘇 南京 210014；4. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇 揚州 225009；5. 天康制藥(蘇州)有限公司，江蘇 蘇州 215000)

偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)又稱豬皰疹病毒1型(suid herpesvirus，SuHV-Ⅰ)，最早由匈牙利科學家所分離[1]。該病毒可引發偽狂犬病(pseudorabies，PR)，許多家畜和野生哺乳動物感染該病會出現神經、呼吸和生殖系統等的癥狀，如瘙癢(小鼠)、繁殖障礙(母豬)、呼吸困難(成年豬)、嘔吐抽搐(仔豬)等[2]。20世紀50年代，我國豬場首次暴發PR，后使用源自匈牙利的弱毒苗Bartha-K61使該病得到了有效控制[3]。然而，2011年以來，PRV變異株在我國豬群中暴發流行，其致病力和傳播力明顯高于傳統毒株，傳統的Bartha-K61已無法提供完全保護[4-5]，新型疫苗的研制迫在眉睫。

TK、PK、gE/gI等為PRV重要的毒力因子，對病毒在哺乳動物機體中的潛伏、入侵有重要作用[6]。科研工作者常把這些基因作為基因工程疫苗的首選靶基因。1985年，Kit等[7]構建了第一株PRV TK基因缺失疫苗。目前，應用變異株研發的gE/gI、gE/TK和TK/gE/gI缺失株可提供有效的保護，但對初生PRV陰性仔豬存在嚴重的安全隱患[8]，暗示其他基因可能影響其毒力。

UL3屬于早期核蛋白，編碼237個氨基酸，大小約為34 kDa[9]。目前UL3的功能尚未明確。研究發現，UL3對單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus type 1，HSV-1)體外復制無顯著影響[10]，但可與UL4、ICP22等相互作用從而影響蛋白質在細胞內的定位[11]。Barbara等[9]發現，UL3蛋白缺失不影響PRV在兔腎細胞上增殖，但關于UL3對動物致病力的影響還未見報道。

UL46基因，編碼PRV晚期蛋白。常與UL47、UL48、UL49基因共同成簇，是病毒被膜蛋白主要成分[12]。研究發現，HSV-1和馬立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV)的UL46皆為非必需蛋白，缺失這類蛋白會影響病毒復制[13-14]。PRV UL46突變株(基因移碼)對小鼠的致病力無顯著影響[15]。

UL50基因，編碼240個氨基酸，具有焦磷酸酶活性。研究發現諸多γ皰疹病毒的UL50可進行免疫調控，但不依賴于焦磷酸酶活性[16-17]。2017年，Zhang等[18]研究發現，PRV和HSV-1的UL50均可誘導Ⅰ型干擾素受體降解，從而拮抗干擾素反應。然而，目前尚無UL50對毒力影響的報道。

本研究以PRV變異株的UL3、UL46和UL50為研究對象，運用細菌人工染色體技術(bacterial artificial chromosome，BAC)構建了PRV AH02LA變異株UL3、UL46和UL50基因失活株：PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock，并對其生物學活性進行了分析，為PRV致病機制的研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒、BAC與實驗動物

PRV AH02LA株由本研究室分離于安徽六安某豬場PR陽性豬[19]；含BACPRV(以PRV AH02LA株為親本毒株，mini-F替換gI和gE基因)的大腸桿菌GS1783由本研究室制備[20]；豬睪丸(swine testis，ST)細胞于本研究室保存。85只SPF級實驗小鼠購自南京市青龍山動物養殖場(合格證編號：20210125Abzz01000000805)。

1.2 主要試劑

LATaqDNA聚合酶、PrimeSTAR Max聚合酶、DL10000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker和250 bp DNA ladder購自TaKaRa公司；胎牛血清、DMEM培養液購自Gibco公司；DNA提取液購自Solarbio公司；DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司；脂質體轉染試劑盒購自Thermo Fisher公司。

1.3 引物設計與合成

引物由擎科生物科技有限公司合成，如表1所示。

表1 引物序列

1.4 重組菌株的構建

以卡那霉素(KAN)抗性基因為模板，分別以UL3knock-KAN F/R、UL46knock-KAN F/R和UL50knock-KAN F/R為引物，PCR擴增含各基因起始密碼子前后同源臂序列的KAN抗性基因。PCR片段回收后，導入含BACPRV的GS1783中進行電轉重組(電壓：1 500 V；電阻：200 Ω；電容：25 μF)，獲得3株重組菌株：BACPRV-UL3knock-KAN、BACPRV-UL46knock-KAN和BACPRV-UL50knock-KAN。第二次重組中，2 mL 3株重組菌株感受態分別加入含2%阿拉伯糖的等量液體培養基，42 ℃振搖15 min，誘導環化重組酶表達，進行Red重組，敲除KAN抗性基因，篩選3株陽性克隆，分別命名為：BACPRV-UL3knock、BACPRV-UL46knock和BACPRV-UL50knock。應用引物UL3 F/R、UL46 F/R和UL50 F/R對3株BAC進行PCR和測序鑒定。

1.5 重組病毒的獲得與鑒定

應用DNA提取試劑盒提取PRV AH02LA病毒DNA，以gE/gI F/R為引物，PCR擴增回收含同源臂的gE/gI序列片段。BACPRV-UL3knock、BACPRV-UL46knock和BACPRV-UL50knockDNA通過堿裂解法提取。應用脂質體轉染法，將10 μL含同源臂的gE/gI序列片段分別與15 μL 3株重組BAC的DNA片段共轉染單層ST細胞，轉染后24 h，在紫外光(488 nm)激發下可見未發熒光的病毒蝕斑，連續挑斑純化3代，獲得3株重組病毒，分別命名為：PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock。PCR和測序鑒定gE/gI基因序列。

1.6 重組病毒遺傳穩定性檢測

重組病毒PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock分別在ST細胞上連續傳代20次，提取F20代病毒基因組DNA，用UL3 F/R、UL46 F/R和UL50 F/R分別對UL3、UL46和UL50基因片段進行擴增，并通過測序鑒定各基因起始密碼子是否發生回補或突變。

1.7 重組病毒體外生長動力學檢測

將PRV AH02LA、PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock病毒分別以0.01感染復數(multiple of infection，MOI)接種ST細胞。于接種后6、12、24、36、48和72 h收集細胞和病毒混合液。經-70 ℃和37 ℃反復凍融3次，12 000 r/min離心10 min，檢測上清病毒滴度，重復3次。應用SPSS 11.0進行統計學分析。

1.8 重組病毒對小鼠致病力測定

選取85只SPF級實驗小鼠，隨機分為17組，每組5只(表2)。取PRV AH02LA(107.75TCID50/mL)、PRV-UL3knock(107.2TCID50/mL)、PRV-UL46knock(106.5TCID50/mL)和PRV-UL50knock(107.3TCID50/mL)種毒，10倍倍比稀釋，稀釋度由100～10-3。攻毒采用頸部皮下注射法，每只小鼠注射0.1 mL的病毒液，對照組注射等量DMEM培養液。攻毒后每日觀察記錄小鼠臨床癥狀，累計14 d，并統計死亡情況。Reed-Muench法計算PRV AH02LA、PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock對小鼠的LD50。

表2 小鼠試驗分組

2 結果

2.1 重組菌株BACPRV-UL3knock、BACPRV-UL46knock和BACPRV-UL50knock的獲得與鑒定

通過第一步Red重組，BACPRV插入KAN抗性基因的同時刪除UL3、UL46和UL50基因起始密碼子，PCR檢測發現，對應菌株的UL3、UL46和UL50基因序列大小增加約1 000 bp(圖1)。然后通過第二步Red重組，敲除KAN抗性基因，分別命名為：BACPRV-UL3knock、BACPRV-UL46knock和BACPRV-UL50knock。PCR(圖1)和測序表明UL3、UL46和UL50起始密碼子已成功敲除。

M. Marker;1. UL3;2. 敲除KAN基因;3. 插入KAN基因;4. UL46;5. 敲除KAN基因;6. 插入KAN基因;7. UL50;8. 敲除KAN基因;9. 插入KAN基因

2.2 重組毒株PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock的獲得與鑒定

BACPRV-UL3knock、BACPRV-UL46knock和BACPRV-UL50knockDNA分別與帶有同源臂的gE/gI序列片段共轉染ST細胞，拯救病毒的同時，gE/gI序列替換mini-F序列，在紫外光(488 nm)下可見未發熒光的病毒蝕斑，經3輪挑斑純化，獲得重組病毒：PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock(圖2)。gE/gI序列經PCR(圖3)和測序鑒定正確。

圖2 重組病毒PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock的純化

M. DL15000 DNA Marker; 1. PRV AH02LA; 2. PRV-UL3knock; 3. PRV-UL46knock; 4. PRV-UL50knock

2.3 重組毒株PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock遺傳穩定性測定

將重組病毒PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock于ST細胞中傳代20次，提取F20代重組病毒DNA，對UL3、UL46和UL50基因進行PCR和測序鑒定，結果表明UL3、UL46和UL50起始密碼子未有發生回補或突變(數據未列出)，表明遺傳穩定性良好。

2.4 重組毒株PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock體外生長動力學檢測

PRV AH02LA、PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock分別以0.01 MOI接種ST細胞，在指定時間點檢測上清與細胞混合物滴度，并繪制其生長曲線(圖4)。PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock在感染后12 h(PRV-UL3knock：102.6TCID50/mL； PRV-UL46knock：0；PRV-UL50knock：102.75TCID50/mL)和36 h(PRV-UL3knock：106.5TCID50/mL；PRV-UL46knock：106.38TCID50/mL；PRV-UL50knock：106.55TCID50/mL)病毒滴度明顯低于親本毒株(12 h：103.0TCID50/mL；36 h：107.5TCID50/mL)。PRV-UL46knock在感染后6 h和12 h未檢測到毒價。以上結果表明，UL3、UL46和UL50可能介導病毒復制。PRV AH02LA、PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock滴度峰值分別為：107.5TCID50/mL、106.8TCID50/mL、106.7TCID50/mL和107.1TCID50/mL。

圖4 PRV AH02LA、PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock體外生長動力學

2.5 PRV AH02LA、PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock對小鼠致病力分析

根據表3統計，計算PRV-UL3knock、PRV-UL46knock和PRV-UL50knock的LD50依次為：104.44TCID50、104.5TCID50和104.05TCID50，與PRV AH02LA親本毒均相似(LD50：104.91TCID50)。表明UL3、UL46和UL50對小鼠致病性無顯著影響。

表3 小鼠試驗結果

續表3

3 討論

2011年以來，PRV變異株給我國養豬業帶來了巨大損失[21-22]，新型疫苗的研發是控制該病的關鍵，一些未知毒力基因的鑒定尤為重要。目前關于UL3、UL46和UL50對PRV復制和毒力的影響尚不明確。因此，本研究通過BAC以及配套的EnPassant技術敲除UL3、UL46和UL50基因起始密碼子，構建3種基因失活株，并進行了體外生長特性和對小鼠致病性的研究。

本研究所采取BAC及其相關的EnPassant技術是皰疹病毒研究的最先進技術，BAC技術使得對皰疹病毒基因組進行缺失、突變和插入的分子生物學操作可以在大腸桿菌中進行，能大大提高研究效率，且基因不易發生變異[23]。本研究第一步重組是將包含UL3、UL46和UL50基因起始密碼子前后同源臂序列的KAN抗性基因電轉至大腸桿菌GS1783，與BACPRV進行同源重組。第二步重組基于溫敏啟動子調控，阿拉伯糖誘導Cre酶表達，完成KAN抗性基因的敲除，從而構建3種基因失活株。

體外生長性能試驗發現，UL3、UL46和UL50突變失活株在感染后12和36 h滴度顯著低于PRV AH02LA親本株，暗示UL3、UL46和UL50可能介導病毒復制。UL3編碼病毒的早期核蛋白，先前研究表明UL3缺失對PRV在兔腎細胞上的復制無顯著影響[9]，因此，關于UL3對PRV在不同細胞復制的影響及其機制需要進一步研究。PRV UL46蛋白可通過拮抗細胞Ⅰ型干擾素反應[24]，從而促進了病毒對細胞的入侵。此外，UL46蛋白可調節核膜破裂(nuclear envelope breakdown，NEBD)，NEBD可促進病毒排出細胞[25-26]，從而加快對其他細胞的入侵。對HSV-1研究發現，UL46缺失降低HSV-1復制水平，減少蝕斑大小[27]。研究表明，PRV與HSV-1 UL50均可以通過降解干擾素受體，抑制α-干擾素反應[14]，促進病毒免疫逃逸。以上研究在一定程度上解釋了UL3、UL46和UL50失活株在感染12和36 h低于親本株的原因，具體作用機制還需進一步研究。此外，后續研究將應用q-PCR對病毒含量進行驗證，也將通過兔腎細胞和BHK-21細胞對3種失活株生長動力學進行鑒定。

小鼠作為PRV的非自然宿主，可引起極高的致死率。對小鼠致病力試驗發現，PRV-UL3knock、PRV-UL46knock、和PRV-UL50knock對小鼠的LD50與PRV AH02LA親本株相似，表明3種蛋白對小鼠致病性無顯著影響。為準確鑒定UL3、UL46和UL50基因是否失活，之后還需通過Western blot進行驗證。

綜上所述，本研究通過BAC以及配套的EnPassant技術構建了UL3、UL46和UL50突變失活株。UL3、UL46和UL50突變失活株在感染12和36 h滴度顯著低于PRV AH02LA親本株，表明UL3、UL46和UL50可能介導病毒復制，具體作用機制需要進一步研究。此外，本研究首次分析了UL3、UL46、UL50基因對PRV毒力的影響，為PRV致病機制的研究提供了參考。