江蘇部分地區(qū)禽致病性大腸桿菌分離株的生物學(xué)特征及耐藥性研究

徐亞亞，袁華根，孫晨明，郭子涵，黃晴

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌(avian pathogenicEscherichiacoli，APEC)所引起的一種常見的細(xì)菌病，制約養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。APEC能導(dǎo)致感染禽類罹患多種臨床病型，如敗血癥、氣囊炎、腹膜炎、肝周炎、心包炎、臍炎、腸炎、滑膜炎和腫頭綜合征等。此外，APEC與其他致人感染的腸道外致病性大腸桿菌，如尿道致病性大腸桿菌和腦膜炎大腸桿菌在表型、毒力基因型等方面高度相似[3-4]，有傳播給人的潛力，因此具有公共衛(wèi)生意義。

APEC臨床分布廣泛，分子生物學(xué)特征復(fù)雜，存在多種生物學(xué)鑒定靶標(biāo)，如血清型、種系發(fā)生分型、毒力基因型和耐藥性等[5]，弄清臨床分離株分子流行特征，尤其是與致病菌株高度關(guān)聯(lián)的分子特征，進(jìn)而采取相應(yīng)的防控手段加以控制，將具有重要的臨床指導(dǎo)意義。本研究從江蘇部分地區(qū)疑似大腸桿菌病的臨床病料中共分離鑒定出120株APEC菌株，并對(duì)分離株的血清型、種系發(fā)生分型、毒力基因型和耐藥型等分子生物學(xué)特征進(jìn)行研究，為指導(dǎo)臨床APEC的鑒定和防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料

2019年7月至2020年12月，從江蘇泰州、揚(yáng)州、南通等地區(qū)疑似大腸桿菌病的病死雞中采集病料，包括肝、脾、肺組織等用于APEC的分離鑒定。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

麥康凱瓊脂，LB培養(yǎng)基，葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、枸櫞酸鹽等細(xì)菌生化微量管，草酸銨結(jié)晶紫染液，盧戈碘液，95%的乙醇溶液，番紅復(fù)染液，MR試劑，V-P試劑，全套大腸桿菌O抗原多因子和單因子血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所[6]。

1.3 藥敏紙片

藥敏紙片：氨芐青霉素(10 μg)、強(qiáng)力霉素(30 μg)、鏈霉素(10 μg)、四環(huán)素(30 μg)、諾氟沙星(10 μg)、慶大霉素(10 μg)、卡那霉素(30 μg)、先鋒IV(30 μg)、左旋氧氟沙星(5 μg)、氟苯尼考(30 μg)、多黏菌素B(30 μg)、磺胺甲基異噁唑(27.5 μg)、新霉素(30 μg)購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司[6]。

1.4 引物

參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]設(shè)計(jì)引物，引物的合成是由上海生工生物工程公司完成的，引物序列以及預(yù)期片段的大小見表1。

表1 PCR擴(kuò)增的毒力基因引物

1.5 試驗(yàn)動(dòng)物

選用購(gòu)自江蘇省揚(yáng)州市高郵種雞場(chǎng)的1日齡羅曼商品代蛋雞。

1.6 試驗(yàn)方法

1.6.1 細(xì)菌分離鑒定

用滅菌接種環(huán)蘸取病料，經(jīng)三區(qū)劃線接種至麥康凱培養(yǎng)基上，置于37 ℃溫箱培養(yǎng)18 h。挑取單菌落進(jìn)一步純化，經(jīng)革蘭染色和生化試驗(yàn)鑒定APEC分離株。

1.6.2 大腸桿菌的O血清型鑒定

利用大腸桿菌O抗原檢測(cè)血清進(jìn)行玻板凝集試驗(yàn)確定分離株的血清型。過(guò)夜培養(yǎng)菌液經(jīng)121 ℃高壓2 h，制備O抗原。在一潔凈的玻板上按1∶1等體積混合O抗原和抗血清，1 min內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集現(xiàn)象的為陽(yáng)性反應(yīng)，同時(shí)也要以細(xì)菌懸液與生理鹽水的混合物作對(duì)照，觀察是否有自凝現(xiàn)象。

1.6.3 種系發(fā)生分型

利用多重PCR方法，分別檢測(cè)APEC分離株的chuA、yjaA以及DNA片段TSPE4.C2基因來(lái)確定分離株的種系發(fā)生分型[8]。種系發(fā)生分型的標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 大腸桿菌種系發(fā)生分型標(biāo)準(zhǔn)

1.6.4 毒力基因的檢測(cè)

參考趙李祥等[7]檢測(cè)APEC毒力基因多重PCR的方法，檢測(cè)鐵攝取相關(guān)基因feoB、iutA、irp-2、iroN和tonB，抗血清殺菌基因iss、traT和cvaC，黏附素基因fimH和papC、毒素基因hlyD和tsh等12種毒力基因在APEC中的分布情況。

1.6.5 1日齡雛雞致病性試驗(yàn)

將過(guò)夜培養(yǎng)菌液濃度調(diào)至1.0×108CFU/mL。1日齡雛雞6只/組，0.1 mL/只，通過(guò)左胸氣囊接種。攻毒后每天上午、下午記錄雞的死亡數(shù)，對(duì)死亡雞剖檢觀察，接種7 d后對(duì)存活雞只撲殺，并分離大腸桿菌，對(duì)分離到的細(xì)菌進(jìn)行血清型鑒定。

參考高崧等[9]判定APEC致病性的標(biāo)準(zhǔn)：致死率≥50%的分離株為高致病菌株，致死率<50%的分離株為低致病菌株。

1.6.6 藥敏試驗(yàn)

試驗(yàn)采用Kirby-Bauer(紙片擴(kuò)散法) 測(cè)量抑菌圈的大小，并參照參照美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[6,10]，判斷細(xì)菌對(duì)各種藥物的敏感程度。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定

分離細(xì)菌經(jīng)過(guò)37 ℃培養(yǎng)18 h后，在麥康凱培養(yǎng)基上形成粉紅色、圓形隆起的菌落；挑取菌落通過(guò)涂片、革蘭染色鏡檢，可見到呈革蘭陰性、兩端鈍圓、間或細(xì)的短桿菌，多單個(gè)和成對(duì)存在；生化試驗(yàn)結(jié)果符合大腸桿菌生化特征。通過(guò)PCR檢測(cè)，本研究共分離鑒定出120株APEC分離株。

M. Marker；1～8. APEC分離株；9. 陽(yáng)性對(duì)照；10. 陰性對(duì)照

2.2 O血清型鑒定

通過(guò)玻板凝集試驗(yàn)對(duì)120株APEC分離株進(jìn)行O血清型鑒定。結(jié)果顯示，能鑒定出O血清型的菌株有95株，剩余25株菌未能定型。定型菌株中主要血清型為O78(27.4%，26/95)、O18(23.2%，22/95)、O24(18.9%，18/95)和O88(15.8%，15/95)，其他血清型占定型菌株14.7%(14/95)。

2.3 APEC種系發(fā)生分型

根據(jù)chuA、yjaA和TSPE4.C2 3種基因的分布組合，將大腸桿菌可以分為A、B1、B2和D這4個(gè)種系發(fā)生型。本研究中APEC分離株種系發(fā)生型以B2型和D型為主，分別占受試分離株的35.6%和28.5%，而A型和B1型分別占22.8%和13.1%。

2.4 APEC分離株毒力基因

對(duì)APEC中已知的12種毒力基因的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，鐵攝取基因的檢出率相對(duì)較高，如tonB(93.3%)、iutA(90.8%)、iroN(84.2%)和feoB(82.5%)，其他受檢基因fimH、iss、cvaC和traT的檢出率也在70%以上，而hlyD、papC、irp-2和tsh基因在APEC菌株中的檢出率低于30%。

2.5 APEC血清型與種系分型的關(guān)系

通過(guò)分析APEC分離株血清型和種系分型的關(guān)系發(fā)現(xiàn)：常見血清型菌株的種系分型也以B2和D型為主，如分離的O78血清型菌株中，B2和D型菌株分別占50%(13/26)和34.6%(9/26)；O18血清型中，B2和D型菌株分別占40.9%(9/22)和36.4%(8/22)；O24血清型中，B2和D型菌株分別占44.4%(8/18)和50.0%(9/18)；O88血清型中，B2和D型菌株分別占40.0%(6/15)和33.3%(5/15)。提示血清型和種系分型之間存在一定的關(guān)聯(lián)性。

表3 120個(gè)APEC分離株的毒力基因檢測(cè)結(jié)果

表4 APEC分離株的血清型及種系分型

2.6 APEC血清型與致病性的關(guān)系

對(duì)篩選的40株不同血清型的菌株進(jìn)行了1日齡雛雞致病性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，其中高致病性菌株26株，占65%；低致病性菌株14株，占35%。所分離的主要血清型O78、O18、O24和O88菌株大都表現(xiàn)為高致病性，提示臨床分離株的致病性較強(qiáng)。

表5 40株APEC分離株的血清型與致病性

2.7 禽致病性大腸桿菌毒力基因與致病性的相關(guān)性

通過(guò)分析40株高、低致病性菌株中毒力基因的分布率發(fā)現(xiàn)，iutA、tsh、iroN、irp-2、iss和cvaC6種毒力基因在高致病性菌株中的分布率顯著高于低致病性菌株(P<0.05)，提示這6種毒力基因可作為鑒定APEC菌株毒力的參考基因。

表6 40株APEC分離株毒力相關(guān)基因與致病性關(guān)系 %

2.8 APEC分離株藥物敏感性

對(duì)120株APEC分離株選取了13種抗生素進(jìn)行藥物敏感性的檢測(cè)，結(jié)果見表7，顯示APEC分離株對(duì)13種抗生素的耐藥率均超過(guò)了50%，特別是對(duì)強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、先鋒IV、氨芐青霉素、磺胺異噁唑的耐藥率均達(dá)到了80%以上。表明臨床上APEC分離株的耐藥性已非常嚴(yán)重，應(yīng)予以重視。

表7 120株APEC分離株的藥敏結(jié)果

3 討論

我國(guó)APEC感染的分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)還很缺乏，給相關(guān)疾病的防治帶來(lái)困難。本研究旨在收集江蘇部分地區(qū)APEC分離株的基礎(chǔ)上，了解本地區(qū)的禽大腸桿菌病分子流行病學(xué)狀況，為深入研究該病的致病機(jī)理和防制措施奠定基礎(chǔ)。

APEC的血清學(xué)分型常規(guī)手段是利用玻板凝集試驗(yàn)檢測(cè)菌體裂解后釋放出的脂多糖O抗原側(cè)鏈，目前關(guān)于APEC的O血清型已有大量報(bào)道。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道，APEC中常見血清型為O1、O2、O35和O78[1,8]。本研究中，從江蘇部分地區(qū)分離鑒定出120株APEC，通過(guò)玻板凝集試驗(yàn)，除25株未能定型外，共鑒定出95株分離株的O血清型，其中主要流行的血清型為O78、O18、O24和O88等。現(xiàn)有的大腸桿菌疫苗大多是在確定O血清型的基礎(chǔ)上制備的，但由于大腸桿菌的血清型比較多，抗原結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜、抗原結(jié)構(gòu)變異也比較大，因此疫苗株很難達(dá)到理想的免疫效果。因此，弄清APEC血清型的區(qū)域性分布，進(jìn)而研發(fā)針對(duì)當(dāng)?shù)亓餍醒逍偷木暌呙纾兄趯?shí)現(xiàn)禽大腸桿菌病的地域性防控。

目前，治療和防控禽大腸桿菌病均以藥物和疫苗為主，使用抗生素類藥物是目前最主要的一種防治途徑。但是，隨著抗生素類藥物的廣泛使用，大腸桿菌的耐藥性逐漸増強(qiáng)、耐藥譜也日益加寬，因此造成的一系列問(wèn)題已備受關(guān)注。對(duì)某一地區(qū)APEC分離株的耐藥性分析，可以了解該地區(qū)禽源大腸桿菌的耐藥情況，指導(dǎo)選擇防治禽大腸桿菌病的藥物。本研究針對(duì)臨床分離株，用13種抗菌藥物進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)菌株的耐藥率均超過(guò)了50%，特別是對(duì)強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、先鋒IV、氨芐青霉素、磺胺異噁唑的耐藥率甚至達(dá)到了80%以上，表明我國(guó)禽源大腸桿菌的耐藥性已非常嚴(yán)重，應(yīng)引起高度重視。因此，進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)APEC的耐藥監(jiān)測(cè)是防控禽大腸桿菌病的重中之重。

APEC致病機(jī)制復(fù)雜尚未完全弄清，因此我們需要深入挖掘新的毒力因子，進(jìn)一步闡述其致病機(jī)制。依據(jù)分子柯赫法則，與APEC致病相關(guān)的部分毒力因子已被報(bào)道，如抗血清存活因子Iss，溫度敏感性血凝素Tsh，攝鐵系統(tǒng)(氣桿菌素、耶爾森菌素等)、大腸桿菌素CvaC等[4, 11-12]。攝鐵系統(tǒng)是APEC重要毒力因子之一，能增強(qiáng)其在環(huán)境中獲得所需要的鐵，提高其生存能力和致病力。本研究對(duì)分離株毒力基因檢測(cè)結(jié)果也證明，鐵攝取相關(guān)基因如tonB、iutA、iroN和irp-2以及抗血清殺菌基因iss的檢出率都很高，表明它們對(duì)于APEC致病性發(fā)揮著重要作用。檢測(cè)APEC臨床分離菌株的毒力因子分布，并經(jīng)1日齡雛雞感染試驗(yàn)明確其致病性，對(duì)于弄清APEC毒力因子分布與高、低致病性菌株之間的關(guān)系具有重要的研究意義。本研究對(duì)高、低致病性菌株進(jìn)行毒力基因檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，受檢的iutA、tsh、iroN、irp-2、iss和cvaC等6種毒力基因在高致病性菌株中的分布率顯著高于低致病性菌株，表明這幾種毒力基因可作為鑒別APEC菌株毒力的參考基因。

綜上，本研究對(duì)江蘇部分地區(qū)的APEC感染進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查，充分了解分離株的血清型、種系發(fā)生分型、毒力基因型和耐藥型等分子生物學(xué)特征，為指導(dǎo)禽大腸桿菌病的防控提供理論依據(jù)。