布氏桿菌S2疫苗株特有基因trbJ的LAMP檢測方法建立

穆嘉明，毛曉偉，石雅琴，秦云，王文龍

(內蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018)

布氏桿菌病是由布氏桿菌引起的自然疫源性人獸共患病，簡稱布病[1]。近年來，我國人間和畜間布氏桿菌病疫情均呈現(xiàn)反彈狀態(tài)，而布病無論是對人類還是對畜牧業(yè)所造成的危害都是巨大的，對人類主要引起長期發(fā)熱、多汗、關節(jié)疼痛等，并且人類普遍易感，不分年齡、性別[2]。對畜牧業(yè)所造成的經(jīng)濟損失甚至無法估算，會造成流產(chǎn)死胎、不孕不育、泌乳期延長、死淘率增加、干擾育種計劃等[3]。

目前我國對布病流行嚴重的地區(qū)主要采取疫苗免疫和檢疫淘汰的防控措施。S2疫苗是由我國自主研制的，該疫苗接種操作簡單、毒力較低、免疫保護效果較好，適于接種動物范圍廣，在我國布病防控中發(fā)揮了重要作用。但該疫苗在應用的過程中也出現(xiàn)了新的問題：當前常用的診斷方法不能識別免疫畜群中自然感染的病畜，無法進行畜群的檢疫凈化。為找出自然感染菌株與S2疫苗株之間的差異，本實驗室對布氏桿菌S2疫苗株進行全基因組測序，與臨床常見的羊、牛種野毒株基因組進行比對分析，并進行功能注釋，結果發(fā)現(xiàn)P型結合轉移蛋白( P-type conjugative transfer protein)基因trbJ為S2疫苗株的特有基因[4]。

自2000年日本科學家發(fā)明環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術以來，LAMP技術被逐漸應用到眾多病原體的檢測中，包括細菌、真菌、病毒、寄生蟲等[5]。該技術可以在1 h內完成擴增反應，對儀器設備的要求較低，恒溫水浴鍋即可，并且可以通過肉眼觀察反應結果，其獨特的優(yōu)勢在對病原體的檢測中顯示出較好的應用前景[6]。本試驗基于LAMP技術和trbJ基因，建立S2-LAMP檢測方法，對該方法的反應體系、反應條件單因素優(yōu)化，并進行特異性、靈敏度、重復性測試，旨在為布氏桿菌病的鑒別診斷和防控凈化提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及DNA

豬種布氏桿菌S2疫苗株、牛種布氏桿菌疫苗株S19，均購自金宇保靈生物藥品有限公司；牛種布氏桿菌疫苗株A19、羊種布氏桿菌疫苗株Rev.1、羊種布氏桿菌野毒株M28的基因組DNA，由本實驗室保存；鏈球菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌的基因組DNA，由本院微生物實驗室提供。

1.2 主要試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技有限公司、PremixTaq(ExTaqVersion 2.0 plus dye)、標準分子量DL2000 Marker、6×loading buffer、dNTPs均購自大連寶生物有限公司、Bst2.0 DNA聚合酶、10×等溫擴增緩沖液、MgSO4購自New England Biolabs公司。SYBR Green I核酸熒光染料購自北京索萊寶生物科技有限公司，礦物油購自愛博生物科技公司。

1.3 trbJ基因的同源性比對及PCR檢測

根據(jù)S2疫苗株trbJ基因序列設計普通PCR引物，引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，并進行實驗驗證。PCR的反應條件是95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；再延伸10 min；擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將S2的trbJ基因與NCBI公布的布氏桿菌基因組進行BLAST比對，對比其同源性。

1.4 LAMP引物設計與篩選

根據(jù)S2疫苗特異性基因trbJ，利用在線軟件Primer Explorer V5設計6條LAMP特異性引物，引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。6條引物的序列信息如表2。

表1 trbJ基因 PCR引物序列

表2 trbJ基因 LAMP引物序列信息

1.5 LAMP反應組分、反應條件的單因素優(yōu)化

以Bst 2.0 DNA聚合酶推薦的組分終濃度為基礎，建立初始LAMP體系。分別對反應組分中的MgSO4、dNTPs、外引物F3/B3、內引物FIP/BIP、環(huán)引物LF/LB進行單因素優(yōu)化。接下來對反應溫度進行優(yōu)化，設置了59、61、63、65、67及69 ℃共計6個溫度梯度，以無菌無酶水作為陰性對照。

1.6 LAMP反應特異性檢測

在確定最佳反應組分、反應溫度的基礎上，為了評價LAMP引物對供試菌株的特異性，用布氏桿菌疫苗株S19、A19、Rev.1、羊種野毒株M28，以及沙門菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌的基因組DNA進行特異性檢測，無菌無酶水作為陰性對照模板。通過目視法、電泳法進行驗證。

1.7 LAMP反應靈敏度檢測

首先測定所用豬種布氏桿菌S2疫苗株DNA的濃度為689 ng/μL，接下來進行10倍濃度倍比稀釋，濃度依次為：689、68.9和6.89 ng/μL，689、68.9和6.89 pg/μL，689、68.9 fg/μL，分別取1 μL作為模板進行LAMP擴增，擴增結束后進行結果分析。用其外引物F3/B3對其進行普通PCR擴增，比較LAMP反應和普通PCR之間的靈敏度差異。

1.8 LAMP反應重復性檢測

用建立好的LAMP檢測方法對同一份布氏桿菌S2疫苗株DNA進行3種不同批次試劑間的重復性檢測，同樣采用目視法、電泳法2種方法進行驗證，并設置陰性對照。

2 結果與分析

2.1 trbJ基因同源性比對及PCR檢測

將S2trbJ基因編碼序列與NCBI公布的6種布氏桿菌基因序列進行BLAST比對，結果如表3顯示：trbJ基因只在豬種、犬種、鼠種中存在，而牛種、羊種、綿羊種中不存在。PCR擴增后通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，只有在豬種S2疫苗中擴增出約180 bp條帶，而在牛種和羊種布氏桿菌的核酸中未出現(xiàn)條帶，結果見圖1。

M. DNA Marker DL2000；1～6泳道分別為S2、S19、A19、Rev.1、M28、陰性對照

菌株種屬GenBank登錄號同源性/%bv.1 str.S2豬種(B.suis)CP045138.1100M5-90羊種(B.melitensis)CP001852.10bv.1 str.941牛種(B.abortus)AE017224.10ATCC 25840綿羊種(B.ovis)CP000708.10RM6/66犬種(B.cains)CP007759.199CCM 4915鼠種(B.microti)CP001579.199

2.2 LAMP反應組分、反應條件優(yōu)化

采用25 μL反應體系，優(yōu)化結果顯示MgSO4最佳終濃度為4 mmol/L；dNTPs最佳終濃度為1.8 mmol/L；外引物F3/B3的最佳終濃度0.2 mmol/L；內引物FIP/BIP的最佳終濃度為1.6 mmol/L；環(huán)引物LF的最佳終濃度為0.6 mmol/L，LB的最佳終濃度為0.4 mmol/L。反應溫度優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)，65 ℃、67 ℃、69 ℃擴增結果差異不明顯，說明該方法對反應儀器的溫度控制精度要求較低，最終選擇Bst酶推薦的65 ℃為最佳反應溫度。

2.3 LAMP 反應特異性檢測

如圖2所示，只有S2疫苗株DNA的LAMP擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現(xiàn)特異性梯形條帶，并且可見光下顏色變化(圖3)與電泳檢測結果一致。而布氏桿菌疫苗株S19、A19、Rev.1，羊種野毒株M28的DNA以及金黃色葡萄球菌、沙門菌、鏈球菌DNA均未發(fā)生LAMP擴增，無條帶、顏色變化。結果說明本研究所設計的S2 LAMP引物，具有良好的特異性。

M. DNA Marker DL2000；1～9泳道分別為S2、S19、A19、Rev.1、M28、金黃色葡萄球菌、沙門菌、鏈球菌、陰性對照

1～9號管分別為S2、S19、A19、Rev.1、M28、金黃色葡萄球菌、沙門菌、鏈球菌DNA、陰性對照

2.4 LAMP 反應靈敏度檢測

隨著反應體系中DNA模板量的逐漸降低，LAMP產(chǎn)物電泳條帶(圖4)、PCR產(chǎn)物電泳條帶(圖5)逐漸變淺。LAMP反應管中熒光也逐漸減弱(圖6)。當模板DNA的量稀釋至689 pg/μL以下時反應管中沒有肉眼可見的SYBR Green的熒光綠色，而通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以最低檢測到6.89 pg/μL的S2疫苗株DNA模板。在PCR擴增反應中，最低可檢測到的模板DNA為689 pg/μL，因此LAMP檢測的靈敏度比普通PCR高100倍。

M. DNA Marker DL2000；1～9泳道分別為689、68.9、6.89 ng/μL，689、68. 9、6.89 pg/μL，689、68.9 fg/μL，陰性對照

M. DNA Marker DL2000；1～9泳道分別為689、68.9及6.89 ng/μL，689、68.9及6.89 pg/μL，689及68.9 fg/μL，陰性對照

1～9號管分別為689 ng/μL、68.9 ng/μL、6.89 ng/μL、689 pg/μL、68.9 pg/μL、6.89 pg/μL、689 fg/μL、68.9 fg/μL，陰性對照

2.5 LAMP 反應重復性檢測

用建立好的LAMP檢測方法對同一管S2基因組DNA進行重復性檢測，試驗采用3種不同批次試劑。結果顯示不同批次試劑LAMP擴增產(chǎn)物電泳條帶亮度相近(圖7)，擴增產(chǎn)物加入染料后目視顏色、熒光變化無明顯差異(圖8)，表明該檢測方法和所用試劑重復性較好。

M. DNA Marker DL2000；1～3泳道分別為3個不同批次反應試劑；4. 陰性對照

3 討論

布氏桿菌病在全世界范圍內流行，不同國家、地區(qū)的布病疫情形勢差別較大，中、低收入的國家仍然是布病流行的嚴重區(qū)域[7]。據(jù)調查結果顯示，近些年我國布病疫情呈現(xiàn)反彈狀態(tài)，自2000年開始，布病陽性家畜的數(shù)量呈逐年上升趨勢[8]。基于我國動物布病疫情形勢，在“預防為主”、“檢疫淘汰”的防控背景下，獲得快速、準確的檢測方法成為解決問題的重中之重。

1～3號管分別為3個不同批次試劑；4號管為陰性對照

最近10年，LAMP技術開始被研究用于布氏桿菌病的診斷中，國內的一些學者依據(jù)布氏桿菌OMP25、OMP31、16S rDNA等保守基因建立了布氏桿菌LAMP檢測方法[9]，但這些方法仍然存在著無法區(qū)分布氏桿菌疫苗株的技術瓶頸。為了探索LAMP技術在布氏桿菌病鑒別診斷中的應用，本試驗以S2疫苗及其特有基因trbJ為研究對象，建立并優(yōu)化了S2-LAMP檢測反應體系與反應條件，并對優(yōu)化后的LAMP檢測方法進行了特異性、靈敏度、重復性測試。試驗證明，該方法靈敏性特異性良好，能準確鑒別出S2疫苗株，與布氏桿菌疫苗株S19、A19、Rev.1、羊種野毒株M28、金黃色葡萄球菌、沙門菌、鏈球菌均無交叉反應。2種技術靈敏度相比，LAMP檢測靈敏度比普通PCR檢測高100倍，并且試劑間的重復性較好。

綜上所述，本試驗建立的LAMP方法在S2疫苗株的檢測上具有較好的特異性，靈敏度高于普通PCR，復性較好。由于該方法對試驗儀器要求較低，普通恒溫水浴鍋即可完成反應，并且反應時間較短、檢測結果可視化，因此該技術在基層推廣應用中具備較大的開發(fā)潛力。