豬RNase L與PRRSV nsp4缺失突變體的構建及其互作研究

于瑩，李均同，叢曉燕，齊靜，劉思當，鄭乾坤，孫文博，王愛國，鄭龍祥，吳香菊,*，杜以軍*，單虎

(1. 青島農業大學動物醫學院，山東 青島 266000；2. 山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室/山東省農業科學院畜牧獸醫研究所，山東 濟南 250100；3. 山東農業大學動物科技學院，山東 泰安 271018；4. 得利斯集團有限公司，山東 諸城 262216)

豬繁殖與呼吸綜合征(procine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的一種高度接觸性傳染病，通過呼吸道、胎盤、生殖道傳播，通常表現為各年齡段豬的呼吸困難以及母豬的生殖衰竭，如晚期流產、死產和木乃伊化，致死率可高達80%～100%[1]，目前仍然是世界范圍內養豬業的主要威脅。PRRS于20世紀80年代末，幾乎同時在北美和歐洲出現，然后在幾年內迅速傳播到世界其他地區。在1991年和1992年分別于荷蘭和美國出現[2]。1996年在愛荷華州和美國其他州暴發了“急性PRRS”[3]。2006年高致病性PRRSV(HP-PRRSV)在中國以未知的方式大規模暴發，傳播到了10多個省(自治市或自治區)，感染了超過200萬頭豬，造成約40萬死亡病例。該病具有唯一的感染宿主，而且一般伴隨混合與繼發性感染。

非結構蛋白nsp4是PRRSV編碼的一種蛋白酶，可以下調免疫反應[4]。通過切割受體或接頭分子IPS-1(interferon-β promoter stimulator 1)、NEMO(NF-κB essential modulator)或IκB的催化亞基IΚΚα顯著抑制I型干擾素的產生，對IFN-β啟動子的激活具有抑制作用。研究表明nsp4激活caspase-3、-8和-9誘導細胞凋亡，并且該誘導凋亡活性依賴于nsp4的絲氨酸蛋白酶活性。PRRSV nsp4的晶體結構[5]揭示了該蛋白由3個結構域組成，包括2個類糜蛋白酶β結構域和1個額外的C-末端α/β結構域，分別位于1～69 aa結構域Ⅰ，89～153 aa結構域II和157～199 aa結構域Ⅲ[6]，其中結構域Ⅰ和Ⅱ形成典型的糜蛋白酶樣兩管折疊。C-末端結構域Ⅲ對于蛋白水解活性是必不可少的，可能參與微調復制酶多蛋白水解[7]。nsp4的活性位點位于結構域Ⅰ和Ⅱ之間，包含典型的催化三聯體His39、Asp64和Ser118[8]。

核糖核酸內切酶L(RNase L)是一種由干擾素誘導產生的抗病毒蛋白(antiviral protein, AVP)，參與機體內的特異性、非特異性免疫。RNase L結構包含3個結構域：N-端錨定蛋白重復區、蛋白激酶同源區、C-端核糖核酸酶區[9]。活化的RNase L切割單鏈RNA，包括病毒RNA和細胞RNA[10]。2-5A依賴的RNase L可以降解核糖體中的rRNA[11]。RNase L還可以誘導細胞凋亡等。本課題組前期探究到sRNase L具有抗PRRSV活性并篩選到sRNase L與PRRSV nsp4互作[12-13]，Silverman等[14]研究發現R462Q的突變也終止了RNase L與2-5A結合區域的翻譯，抑制了2-5A對RNase L的激活。Dong等[15]證明RNase L突變體W632A、D661A、R667A和H672A缺乏核糖核酸酶活性。Nakanishi等[16]試驗證明Tyr712和Phe716對RNA的結合和切割功能起到重要的作用。本研究將分別構建sRNase L突變體、缺失體及nsp4的截短體，通過免疫共沉淀試驗篩選兩者的互作區段及位點，為深入探究sRNase L與nsp4互作抗PRRSV機制奠定基礎，并為PRRSV感染的防控提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚胎腎上皮細胞(HEK-293T)、pXJ41-Flag-sRNase L、pXJ41-HA-nsp4和空載體pXJ41由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

DNA Marker DL5000、DNA Marker DL2000、Prime STAR HS DNA Ploymerase等購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；pfu Ultra High Fidelity DNA Ploymerase購自Stratagene公司；限制性內切酶HindⅢ、KpnⅠ、DpnⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ及T4 DNA Ligase購自Fermentas公司；質粒小提試劑盒、DNA回收試劑盒購自北京天根生物工程有限公司；WesternBright Sirius化學發光檢測試劑盒購自Advansta公司；細胞裂解液、Western blot一抗稀釋液購自碧云天公司；轉染試劑Lipofectamine?3000購自Invitrogen公司；NC膜購自Bio-RAD公司；青鏈霉素混合液、Flag-beads、PMSF、Tween-20、cocktail購自Sigma公司；Opti-MEM、高糖型DMEM細胞培養基、胰蛋白酶購自Gibco公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔抗體購自武漢博士德公司；DH5α感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司；血清購自BI公司；β-actin抗體購自Santa Cruz公司；兔源HA抗體、鼠源HA抗體、兔源Flag抗體、鼠源Flag抗體購自Sigma公司。

1.3 引物設計

根據文獻報道，結合載體pXJ41的酶切位點，設計了3對含HA標簽序列擴增nsp4 3個結構域的特異性引物；4對含Flag標簽序列擴增RNase L突變體的特異性引物；1對含Flag標簽序列擴增RNase L缺失體的特異性引物；以實驗室保存的HA-nsp4、Flag-RNase L為模板，進行PCR擴增，引物送北京擎科生物技術有限公司合成，引物信息如表1所示。

表1 PCR引物及序列

1.4 pXJ41-Flag-sRNase L突變體的PCR擴增

以pXJ41-Flag-sRNase L質粒為模板，用Flag-sRNase L突變體上下游引物進行PCR擴增，反應體系為25 μL：pXJ41-Flag-sRNase L 100 ng，dNTP 1.5 μL，10×pfu buffer 2.5 μL，Flag-sRNase突變體上下游引物各0.7 μL，pfu Ultra High Fidelity DNA Ploymerase 0.5 μL，ddH2O補足25 μL。PCR反應條件為95 ℃預變性2 min；95 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸7 min，25個循環；72 ℃延伸7 min。PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。

1.5 pXJ41-Flag-sRNase L突變體重組質粒的構建及鑒定

用DpnⅠ酶切pXJ41-Flag-sRNase L突變體PCR擴增產物，將酶切產物轉化到DH5α感受態細胞中，37 ℃過夜培養16 h，挑取單菌落接種于含有氨芐西林抗性的LB培養基中，37 ℃，200 r/min過夜培養，第2天提取質粒，送北京擎科生物科技有限公司測序。

1.6 缺失體Flag-sRNase L 1～586aa的PCR擴增

以pXJ41-Flag-sRNase L為模板，以Flag-sRNase L 1～586 aa-Fwd和Flag-sRNase L 1～586 aa-Rev作為上下游引物，PCR擴增缺失體Flag-sRNase L1～586 aa基因，PCR反應體系為25 μL：pXJ41-Flag-sRNase L 100 ng，dNTP 2 μL，5×Prime STAR Buffer 5 μL，Flag-sRNase L 1～586 aa-Fwd和Flag-sRNase L 1～586 aa-Rev各0.7 μL，Prime STAR HS DNA Ploymerase(2.5 U/μL)0.25 μL，ddH2O補足25 μL。PCR反應條件為98 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，30個循環；72 ℃延伸7 min。PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。

1.7 HA-nsp4截短體的PCR擴增

以pXJ41-HA-nsp4為模板，分別以HA-nsp4-D1/D2/D3-Fwd和HA-nsp4-D1/D2/D3-Rev作為上下游引物，PCR擴增HA-nsp4截短體基因，PCR反應體系為25 μL：pXJ41-HA-nsp4 100 ng，dNTP 2 μL，5×Prime STAR Buffer 5 μL，HA-nsp4-D-Fwd和HA-nsp4-D-Rev各0.7 μL，Prim STAR HS DNA Ploymerase(2.5 U/μL)0.25 μL，ddH2O補足25 μL。PCR反應條件為98 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環；72 ℃延伸7 min。PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。

1.8 重組質粒的構建及鑒定

用KpnⅠ和Hind Ⅲ分別雙酶切缺失體Flag-sRNase L 1～586aa、HA-nsp4截短體基因和pXJ41載體的膠回收產物，分別將缺失體Flag-sRNase L 1～586aa基因和HA-nsp4截短體基因與pXJ41載體用T4 DNA Ligase 16 h過夜連接。次日，將連接產物轉化到DH5α感受態細胞中，37 ℃過夜培養，挑取單菌落接種于含有氨芐西林的LB固體培養基中，37 ℃，200 r/min過夜培養，第2天提取質粒，進行KpnⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定。鑒定為陽性的質粒送北京擎科生物科技有限公司測序。

1.9 轉染

HEK-293T細胞在6 cm圓盤中進行培養，待細胞密度達到104個/mL時，利用Lipofectamine?3000轉染試劑將2.5 μg的HA-nsp4分別與的2.5 μg的pXJ41、pXJ41-Flag-sRNase L、pXJ41-Flag-sRNase L R460A、pXJ41-Flag-sRNase L R675A、pXJ41-Flag-sRNase L Y720A、pXJ41-Flag-sRNase L F724A、缺失體pXJ41-Flag-sRNase L 1～586 aa按Lipofectamine?3000說明書共轉染到細胞中；將2.5 μg的pXJ41-Flag-sRNase L分別與2.5 μg的pXJ41、pXJ41-HA-nsp4-D1、pXJ41-HA-nsp4-D2、pXJ41-HA-nsp4-D3按Lipofectamine?3000說明書共轉染到HEK-293T細胞中。

1.10 免疫共沉淀(Co-IP)及Western blot

轉染24 h后，將6 cm圓盤置冰上，棄上清，用 PBS洗2遍后加500 μL細胞裂解液裂解細胞，20 min后將樣品收集到1.5 mL EP管中，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取60 μL上清與上樣緩沖液混合煮沸10 min標記為input樣品，用于鑒定蛋白表達情況。剩余上清加入Flag-beads，4 ℃旋轉孵育4 h，孵育結束后，4 500 r/min離心2 min棄上清，用1 mL細胞裂解液重懸，重復洗5遍，棄上清后與上樣緩沖液混合煮沸15 min標記為免疫共沉淀樣品(IP樣品)，用于檢測互作情況。

將樣品進行SDS-PAGE并轉印到NC膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，IP樣品分別用一抗稀釋液稀釋的兔抗HA、兔抗Flag作為一抗；input樣品分別用鼠抗HA、鼠抗Flag、鼠抗β-actin抗體作為一抗，4 ℃下過夜孵育，二抗室溫下孵育1 h，用化學發光顯色試劑盒WesternBright Sirius進行顯色，BIO-RAD凝膠成像儀進行曝光。

2 結果與分析

2.1 目的基因的擴增

通過PCR擴增獲得pXJ41-Flag-sRNase L R460A、pXJ41-Flag-sRNase L R675A、pXJ41-Flag-sRNase L Y720A、pXJ41-Flag-sRNase L F724A、缺失體Flag-sRNase L 1～586 aa、HA-nsp4-D1、HA-nsp4-D2、HA-nsp4-D3基因。擴增產物經過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測到大小為6 525 bp(pXJ41-Flag-sRNase L)(圖1A)、6 525 bp(pXJ41-Flag-sRNase L突變體)(圖1A)、2 256 bp(Flag-sRNase L)(圖1B)、1 782 bp(缺失體Flag-sRNase L 1～586aa)(圖1B)、639 bp(HA-nsp4)(圖1C)、267 bp(HA-nsp4-D1)(圖1C)、317 bp(HA-nsp4-D2)(圖1C)、177 bp(HA-nsp4-D3)(圖1C)的特異性擴增片段，與預期片段大小相符。

A. pXJ41-Flag-sRNase L、pXJ41-Flag-sRNase L R460A、pXJ41-Flag-sRNase L R675A、pXJ41-Flag-sRNase L Y720A、pXJ41-Flag-sRNase L F724A基因的PCR擴增產物；B. Flag-sRNase L、缺失體Flag-sRNase L 1～586 aa基因的PCR擴增產物；C：HA-nsp4、HA-nsp4-D1、HA-nsp4-D2、HA-nsp4-D3基因的PCR擴增產物

2.2 pXJ41-Flag-sRNase L突變體質粒構建及鑒定

重組質粒pXJ41-Flag-sRNase L各突變體測序結果表明質粒pXJ41-Flag-sRNase L R460A、pXJ41-Flag-sRNase L R675A、pXJ41-Flag-sRNase L Y720A、pXJ41-Flag-sRNase L F724A構建成功(圖2)。

A. pXJ41-Flag-sRNase L R460A；B. pXJ41-Flag-sRNase L R675A；C. pXJ41-Flag-sRNase L Y720A；D. pXJ41-Flag-sRNase L F724A

2.3 pXJ41-HA-nsp4截短體質粒構建及鑒定

重組質粒pXJ41-HA-nsp4-D1、pXJ41-HA-nsp4-D2、pXJ41-HA-nsp4-D3經EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切后得到預期大小片段(圖3A)，測序結果表明質粒pXJ41-HA-nsp4-D1、pXJ41-HA-nsp4-D2、pXJ41-HA-nsp4-D3構建成功。

2.4 缺失體pXJ41-Flag-sRNase L 1-586aa質粒構建及鑒定

重組質粒缺失體pXJ41-Flag-sRNase L 1～586 aa經KpnⅠ/Hind Ⅲ雙酶切后得到預期大小片段(圖3B)，測序結果表明質粒缺失體pXJ41-Flag-sRNase L 1～586 aa構建成功。

A. pXJ41-HA-nsp4-D1、pXJ41-HA-nsp4-D2、pXJ41-HA-nsp4-D3雙酶切鑒定；B. 缺失體pXJ41-Flag-sRNase L 1～586 aa雙酶切鑒定

2.5 免疫共沉淀篩選與nsp4互作的sRNase L位點及區段

pXJ41-HA-nsp4分別與pXJ41-Flag-sRNase L R460A、pXJ41-Flag-sRNase L R675A、pXJ41-Flag-sRNase L Y720A、pXJ41-Flag-sRNase L F724A、缺失體pXJ41-Flag-sRNase L 1～586aa、pXJ41-Flag-sRNase L、pXJ41共轉染到HEK-293T細胞中，pXJ41-Flag-sRNase L R460A、pXJ41-Flag-sRNase L R675A、pXJ41-Flag-sRNase L Y720A、pXJ41-Flag-sRNase L F724A、缺失體pXJ41-Flag-sRNase L 1～586aa、pXJ41-Flag-sRNase L以及pXJ41-HA-nsp4質粒均成功表達；免疫共沉淀結果顯示， pXJ41-Flag-sRNase L R460A、pXJ41-Flag-sRNase L R675A、pXJ41-Flag-sRNase L Y720A、pXJ41-Flag-sRNase L F724A、pXJ41-Flag-sRNase L分別與pXJ41-HA-nsp4發生了相互作用，但缺失體pXJ41-Flag-sRNase L 1～586aa未與nsp4發生互作，表明sRNase L第3結構域(587～744aa)為與nsp4互作區段，但不包括第675位精氨酸、第720位酪氨酸、第724位苯丙氨酸。見圖4。

A. IP樣品用兔源HA抗體做Western blot檢測nsp4互作條帶；B. IP樣品用兔源Flag抗體做Western blot檢測sRNase L條帶；C. Input樣品直接做Western blot檢測sRNase L、sRNase L突變體、缺失體的表達情況；D. Input樣品直接做Western blot檢測nsp4的表達情況

2.6 免疫共沉淀篩選與sRNase L互作的nsp4區段

將pXJ41-Flag-sRNase L分別與pXJ41、pXJ41-HA-nsp4-D1、pXJ41-HA-nsp4-D2、pXJ41-HA-nsp4-D3共轉染到HEK-293T細胞中。pXJ41-HA-nsp4-D1、pXJ41-HA-nsp4-D2、pXJ41-HA-nsp4-D3以及pXJ41-Flag-sRNase L質粒均成功表達；免疫共沉淀結果顯示，pXJ41-HA-nsp4-D1與pXJ41-Flag-sRNase L發生了相互作用。見圖5。

A. IP樣品用兔源HA抗體做Western blot檢測nsp4截短體互作條帶；B. IP樣品用兔源Flag抗體做Western blot檢測sRNase L條帶；C. Input樣品直接做Western blot檢測sRNase L的表達情況；D. Input樣品直接做Western blot檢測nsp4截短體的表達情況

3 討論

PRRSV是目前影響世界養豬業最重要的病毒之一， nsp4參與了宿主的先天免疫應答，與病毒的免疫調節能力密切相關。nsp4蛋白酶具有3C樣絲氨酸蛋白酶(3CLSP)活性[17]。本研究將sRNase L與hRNase L進行同源性比對，根據序列比對結果設計引物，利用本實驗室保存的pXJ41-Flag-sRNase L質粒，構建得到質粒pXJ41-Flag-sRNase L突變體、缺失體pXJ41-Flag-sRNase L 1～586 aa；根據nsp4三個結構域設計引物，利用實驗室保存的pXJ41-HA-nsp4質粒，構建得到質粒pXJ41-HA-nsp4-D1、pXJ41-HA-nsp4-D2、pXJ41-HA-nsp4-D3，在HEK-293T細胞中進行轉染，通過SDS-PAGE和Western blot檢測證實pXJ41-Flag-sRNase L突變體、缺失體pXJ41-Flag-sRNase L 1-586 aa、pXJ41-HA-nsp4-D1、pXJ41-HA-nsp4-D2、pXJ41-HA-nsp4-D3表達成功。

本研究將nsp4分成分別包含3個結構域的截短體pXJ41-HA-nsp4-D1(1～80 aa)、pXJ41-HA-nsp4-D2(60～156 aa)、pXJ41-HA-nsp4-D3(157～204 aa)，通過Co-IP證實pXJ41-Flag-sRNase L能夠與pXJ41-HA-nsp4-D1發生互作，其余2個結構域的截短體(pXJ41-HA-nsp4-D2、pXJ41-HA-nsp4-D3)均不能與sRNase L發生互作，說明nsp4的第一個結構域(pXJ41-HA-nsp4-D1)是與sRNase L發生互作的必要條件。圖4A、圖5A結果顯示，免疫共沉淀后出現的條帶為pXJ41-HA-nsp4和pXJ41-HA-nsp4-D1蛋白的大小，說明pXJ41-Flag-RNase L與pXJ41-HA-nsp4之間不是通過共價鍵結合的。

RNase L是一種內切單鏈RNA的核糖核酸酶，這種核酸酶只有很低的序列特異性[18]。目前人的RNase L(hRNase L)已研究比較透徹。Silverman等[14]研究發現R462Q的突變也終止了RNase L與2-5A結合區域的翻譯，抑制了2-5A對RNase L的激活。Dong等[15]證明RNase L突變體W632A、D661A、R667A和H672A缺乏核糖核酸酶活性。Nakanishi等[16]試驗證明Tyr712和Phe716對RNA的結合和切割功能起到重要的作用。sRNase L活性位點尚無報道，sRNase L和hRNase L氨基酸同源性為79.2%，且已報道的hRNase L活性位點在sRNase L序列中高度保守，我們根據hRNase L活性位點構建了對應的pXJ41-Flag-sRNase L R460A、pXJ41-Flag-sRNase L R675A、pXJ41-Flag-sRNase L Y720A、pXJ41-Flag-sRNase L F724A，Co-IP證實sRNase L第3結構域(587～744 aa)為與nsp4互作區段，但不包括第675位精氨酸、第720位酪氨酸、第724位苯丙氨酸。本研究確定與nsp4互作的sRNase L的區段為第3結構域(587～744 aa)，并將與sRNase L互作的nsp4區段縮小到1～60 aa，為進一步探究sRNase L與nsp4互作抗PRRSV機制奠定了堅實的基礎。