竹蓀多糖的提取工藝及其體外抗氧化性研究進展

李宇浩，馬宇軒，羅婷，靳海松，韓偉

（華東理工大學(xué)藥學(xué)院制藥工程與過程化學(xué)教育部工程研究中心，上海市新藥設(shè)計重點實驗室，上海200237）

竹蓀（Dictyophora Indusuata）又名竹笙、網(wǎng)紗菌、竹姑娘等，屬于擔(dān)子菌亞門（

Basidiomycotina

）、鬼筆科（

Phallaceae

），適合生長在含有大量枯竹殘體和腐殖質(zhì)的竹林里，我國常見的有長裙竹蓀、短裙竹蓀、紅托竹蓀、棘托竹蓀4個品種，主要分布在四川、云南、福建等地。竹蓀營養(yǎng)價值高，在我國食用、藥用歷史悠久，其在唐代《酉陽雜俎》中就有詳細記載，是“色、味、香、形”四絕的“草八珍”之一，“菌中四珍”之首，素有“山珍之王”“菌中皇后”之稱。在傳統(tǒng)中醫(yī)理論中，竹蓀性溫、味甘微苦，對活血益氣、健脾胃、助消化有理想的療效，是食療的重要材料之一。竹蓀含有多糖等多種有效物質(zhì)。本文論述了竹蓀多糖的提取工藝及其體外抗氧化性，以期為多糖類化合物提取和抗氧化類保健食品的研發(fā)提供幫助。

1 竹蓀多糖的藥理作用

在中國傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)理論中，竹蓀性涼，味甘微苦，十二經(jīng)脈中屬手太陰肺經(jīng)與足厥陰肝經(jīng)。《菌譜》《中華本草》等中醫(yī)著作記載其有“寧神健體、益氣補腦、潤肺養(yǎng)陰、消炎止痛、清熱利濕”的功效，對于肺虛、熱咳、咽喉炎、風(fēng)濕、痢疾等癥有明顯的緩解效果。現(xiàn)代科學(xué)研究表明，廣泛存在于竹蓀子實體細胞壁中的多糖等具有高活性的大分子物質(zhì)，在抗腫瘤、抗氧化、抗血栓、增強免疫力等方面具有一定的功效。國外在二十世紀七八十年代就有竹蓀多糖的相關(guān)報道。

1.1 抗腫瘤作用

國內(nèi)外學(xué)者對于竹蓀的研究發(fā)現(xiàn)，其提取物對腫瘤有一定抑制作用，其主要活性物質(zhì)為竹蓀多糖。林玉滿等從短裙竹蓀子實體中分離得到多糖Dd、Dd-S3P、Dd-2DE，從長裙竹蓀子實體中純化分離得到多糖DI、DiA、Di-S2P，從棘托竹蓀中分離得到多糖DE2-2，經(jīng)動物試驗表明，其中Dd、Dd-S3P和DE2-2對小鼠肉瘤S180具有一定的抑制作用，抑制率分別為44.93%、31.3%、38.93%。趙凱等從紅托竹蓀子實體菌提取得到組分DRVP1和DRVP2，其中DRVP1在含量為1.0 mg/mL時，在體外對小鼠S180腫瘤的抑制率高達70%。杜昱光等在對竹蓀深層發(fā)酵菌絲提取液進行實驗時發(fā)現(xiàn)，其對小鼠S180腫瘤抑制率為40.63%。UKAI等研究發(fā)現(xiàn)，竹蓀多糖T-4-N、T-5-N在小鼠體內(nèi)5 mg/kg用量下即可抑制S180皮下移植瘤的生長，其抑制率為58%。Zhong等發(fā)現(xiàn)竹蓀多糖PDI在體外直接抑制S180細胞生長，用5 mg·mL處理S180細胞72 h后，對S180抑制率為13.9%。

1.2 抗氧化作用

關(guān)于竹蓀多糖抗氧化性的研究證明，竹蓀多糖不僅在實驗室體外化學(xué)體系中具備抗氧化活性，而且在動物實驗中的抗氧化活性也表現(xiàn)良好。Deng等發(fā)現(xiàn)長裙竹蓀多糖DIP具有較強的體外還原能力，能夠有效清除DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基。王蓓蓓等證明在0.2～1.2 mg·mL紅托竹蓀子實體粗多糖和Deng等發(fā)現(xiàn)的DIP效果類似，且其體外抗氧化性比BHT稍強，但較維生素C稍弱。Yu等發(fā)現(xiàn)棘托竹蓀多糖溶液能夠緩解雙氧水所介導(dǎo)的PC12大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞活力下降癥狀，并減少促凋亡蛋白Bax、半胱天冬酶Caspases-3和細胞色素水平，同時增加抗凋亡蛋白Bcl-2的含量，表明其抗氧化活性可能與抑制細胞凋亡等因素密切相關(guān)。

由于氧化脅迫與機體衰老以及神經(jīng)退行性疾病、癌癥等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并且已經(jīng)證實某些抗氧化劑的確能夠延緩衰老和防治氧化脅迫相關(guān)疾病，因此可以推知竹蓀多糖存在某些和抗衰老、緩解氧化脅迫相關(guān)疾病的生物活性。

1.3 免疫調(diào)節(jié)作用

現(xiàn)代研究表明竹蓀多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用。上世紀UKAI等就已經(jīng)從長裙竹蓀子實體中得到具有免疫調(diào)節(jié)作用的直鏈甘露聚糖和葡聚糖。熊彬、郭渝南等經(jīng)對照研究分別發(fā)現(xiàn)，竹蓀菌托菌蓋提取液能修復(fù)輻射損傷，促進免疫細胞分化，提高T細胞生長因子指數(shù)，激活免疫細胞，修復(fù)輻射損傷后的免疫抑制狀態(tài)。推測其作用機理，可能是提取液中存在竹蓀多糖，由多糖對生物機體的免疫作用進行調(diào)節(jié)。徐方等認為真菌多糖參與免疫的功能可能與其對白細胞介素、干擾素的促誘生作用及腫瘤壞死因子有關(guān)，也可能與多糖激活T細胞和B細胞的作用有關(guān)。杜昱光等則認為是竹蓀多糖作用于免疫系統(tǒng)，明顯提高了大鼠外周血T淋巴細胞的比例，增強了中性白細胞的吞噬能力，同時促進脾臟抗體的合成，從而增強動物的免疫功能。此外，民間傳聞里還有紅托竹蓀可以治療白血病，棘托竹蓀能緩解腳氣的偏方。

1.4 抑菌作用

黃慶斌等實驗發(fā)現(xiàn)，竹蓀多糖乙醇醇沉組分對青春雙歧桿菌的增殖有明顯抑制作用，隨著分級醇沉濃度的不斷上升，培養(yǎng)基中青春雙歧桿菌的濃度圖像呈現(xiàn)增大后持續(xù)減小的上凸曲線，當(dāng)分級醇沉濃度達到80%時，抑制青春雙歧桿菌體外增殖的作用最為顯著。盧惠妮、藍蔚青等分別發(fā)現(xiàn)棘托竹蓀子實體提取物對單增李斯特菌和副溶血性弧菌有較好抑制作用。羅盛蓮等研究結(jié)果證明，棘托竹蓀子實體干粉乙酸乙酯浸膏對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌等8種細菌都有明顯的抑制效果。郝景雯等研究表明，長裙竹蓀子實體粉乙醇提取物對細菌有很明顯的抑制作用，而對酵母和霉菌的抑制作用較弱，究其抑菌機理，推測可能是由于竹蓀內(nèi)多糖物質(zhì)對細菌細胞的細胞膜的破壞能力較強，從而導(dǎo)致細菌胞膜受損和細胞質(zhì)溶出，致使其死亡。

2 竹蓀多糖的提取工藝

如何提高竹蓀多糖的得率，降低生產(chǎn)成本，并且不破壞多糖的生物活性，這對于減緩細胞衰老，延長細胞壽命，最終惠及人類、保護人體健康有著不可忽視的意義。竹蓀多糖的提取方法總體有水提醇沉法、酶提取法、超聲波輔助法、壓力輔助法、微波輔助法等。

2.1 水提醇沉法

多糖類物質(zhì)易溶于水，一般不溶于乙醇、乙醚等有機溶劑。水提醇沉法即為用水為溶劑將多糖進行萃取，再經(jīng)歷濃縮、乙醇結(jié)晶等步驟得到竹蓀多糖。水提醇沉法是多糖提取的基本方法，本文介紹的多糖提取輔助方法均需要與水提醇沉法進行配合使用。

水提醇沉法的本質(zhì)是將樣品中的有效物質(zhì)通過浸泡的方法進行提取，是天然物質(zhì)成分由固至液提取最常見的方法。由于提取劑pH不同，其大致可分為熱水浸提法和酸堿浸提法。熱水浸提法主要提取結(jié)合態(tài)和非結(jié)合態(tài)的多糖，本質(zhì)是萃取技術(shù)；酸堿浸提法是通過破壞多糖與其他物質(zhì)結(jié)合的化學(xué)鍵，使多糖變?yōu)橛坞x態(tài)后再進行提取。這其中以熱水浸提法使用較為普遍，但由于成本較高、得率較低且存在污染問題，現(xiàn)在大多不單獨使用水提醇沉法進行多糖提取。

在初中數(shù)學(xué)學(xué)習(xí)過程中，由于很多概念和知識都是初次接觸，所以往往會唐學(xué)生在內(nèi)心產(chǎn)生恐懼的心理，例如初中中剛接觸的方程。因此對于方程這個知識點的教授應(yīng)該采用數(shù)形結(jié)合的方式。將方程的知識與數(shù)形結(jié)合緊密聯(lián)合起來，就可以將一道復(fù)雜難懂的方程題完美解答。例如方程中常見的追擊等問題，都可以采用這種思維模式簡答出來。

2.2 酶解提取法

對于竹蓀多糖的提取，使用傳統(tǒng)的水提醇沉法，多糖難以從細胞內(nèi)釋放出來，從而導(dǎo)致多糖得率低且成本高。而將酶解技術(shù)應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取制備，不僅技術(shù)成熟、操作簡便，而且成本較為低廉。葉敏將纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等組成復(fù)合酶進行試驗提取竹蓀多糖，發(fā)現(xiàn)最佳工藝條件為復(fù)合酶濃度1.5%，酶解時間120 min，酶解溫度50℃，pH值4.5，在此條件下多糖得率為7.98%，相較于單一使用水提醇沉法有明顯增加。

2.3 超聲波輔助法

超聲波輔助法是利用頻率在20～50 kHz的機械波，產(chǎn)生空穴效應(yīng)、熱效應(yīng)和機械效應(yīng)而實現(xiàn)的。當(dāng)其作用于細胞壁，空穴作用產(chǎn)生的效果使液體微粒間發(fā)生猛烈的撞擊作用，從而達到破壞細胞壁，加速細胞內(nèi)容物溶解，使有效物質(zhì)擴散后進行提取的目的，用以縮短提取時間和提高提取效率。

超聲波輔助法是通過物理因素破壞細胞壁，因此其不對所提取物的結(jié)構(gòu)、活性產(chǎn)生影響，且不受成分極性和分子量大小的限制，適用于絕大多數(shù)有效成分的提取，又因為其具有操作簡單易行且提取料液雜質(zhì)少，有效成分易于分離純化等優(yōu)點，在各類有機化合物的提取中應(yīng)用廣泛。

2.4 壓力輔助法

當(dāng)前文獻中，有關(guān)竹蓀多糖壓力輔助提取的研究并不多見，更缺少該法下所得多糖的抗氧化活性的報道。王榮坤等通過壓力輔助提取法，發(fā)現(xiàn)粗多糖提取率低，而純度高達81.46%，純多糖提取率介于水提醇沉法和超聲波輔助法二者之間。在壓力輔助條件下，竹蓀多糖提取時間短、純度高，對于多糖類物質(zhì)的提取研究有所幫助。

2.5 微波輔助法

微波輔助提取法是指使用適當(dāng)?shù)娜軇┰谖⒉ǚ磻?yīng)器中，使用頻率在300 MHz至300 GHz的電磁波，利用電磁場的作用從樣品中提取各種化學(xué)成分的技術(shù)。微波輔助提取是通過高頻電磁波穿透萃取介質(zhì)到達樣品內(nèi)部，使其吸收微波攜帶的能量或由于激發(fā)和瞬時極化釋放的能量，導(dǎo)致細胞內(nèi)部溫度迅速上升，使細胞破裂，有效成分擴散至提取介質(zhì)中，便于之后分離純化。

微波輔助法具有加熱迅速、節(jié)能高效、控制簡便、環(huán)境友好、安全可靠等顯著優(yōu)點，并能夠較好地完成存在于固體或半固體物質(zhì)中的有機物提取，可有效使其與原有基體分離且保持原有結(jié)構(gòu)等狀態(tài)，尤其在熱敏物質(zhì)提取等方面具有特殊意義。

3 竹蓀多糖體外抗氧化性研究

近年來，抗氧化作用是真菌多糖的重要研究方向之一。相比于其他外源性抗氧化劑，真菌多糖所具有的毒性低、副作用小、來源廣等顯著優(yōu)點備受研究者們青睞。現(xiàn)有研究表明，多種真菌多糖能夠清除自由基、提升抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過氧化性活性，從而起到延緩衰老的作用。從國內(nèi)研究結(jié)果得知，竹蓀多糖體外抗氧化性主要通過研究其對ABTS自由基、DPPH自由基、超氧陰離子等物質(zhì)的清除能力來判定。

3.1 ABTS自由基清除活性作用

敢小雙等通過實驗發(fā)現(xiàn)，ABTS自由基會受到竹蓀多糖的抑制作用，當(dāng)竹蓀多糖的濃度達到0.6 mg·mL時，ABTS自由基的清除率達到92.76%，抗氧化能力較好，故其可作為抗氧化劑進行儲備。

3.2 DPPH自由基清除活性作用

DPPH自由基是在517 nm附近有強吸收(顯深紫色)且溶于有機溶劑呈紫色的自由基。當(dāng)與具有抗氧化性的樣品反應(yīng)后，DPPH自由基的褪色程度與其被清除程度成定量關(guān)系，因此可通過分析其褪色程度來檢測樣品的抗氧化性強弱。其常用于定量測定藥品、食品和生物式樣的抗氧化能力。

王榮琨等通過研究不同提取方法的竹蓀多糖對DPPH自由基清除率的影響發(fā)現(xiàn)，超聲波輔助提取的多糖對于DPPH自由基的清除能力是最強的，在竹蓀粗多糖濃度為2 mg·mL時可以達到60.69%。敢小雙等研究濃度對DPPH自由基清除率的影響時證明，隨著質(zhì)量濃度的增加，竹蓀多糖對DPPH自由基的清除率逐漸增大，且當(dāng)竹蓀多糖濃度為25 mg·mL時，對DPPH自由基的清除率達到70.55%。林陳強等在實驗中分別用水、乙醇和乙酸乙酯等溶劑對棘托竹蓀菌蓋破碎物進行浸泡提取，發(fā)現(xiàn)其中醇提物清除DPPH自由基的能力最強。韓樂等通過研究表明，棘托竹蓀發(fā)酵菌絲體和發(fā)酵液的醇提物抗氧化活性均較好，并且其中菌絲體20%醇提物的抗氧化性最強，清除DPPH自由基的IC為0.012 mg·mL。

3.3 超氧陰離子基清除作用

鞏貴麗等通過實驗發(fā)現(xiàn)，不同濃度酶提所得的菌裙（柄）多糖對超氧陰離子有不同的清除能力：當(dāng)多糖濃度從0.4 mg·mL增加到2.0 mg·mL時，各多糖對超氧陰離子的清除率逐漸增加，且增幅逐漸趨于緩和。當(dāng)各種多糖濃度為2.0 mg·mL時，DIPs2對超氧陰離子基的清除率達到最高33.41%，其余依次為DIPs1(31.76%)、DIPs4(29.23%)及DIPs3(27.72%)。相比發(fā)現(xiàn)，各多糖均表現(xiàn)出較低的超氧陰離子清除水平。

綜上所述，竹蓀多糖對于以上自由基均表現(xiàn)出了較好的清除作用和還原作用，可見對竹蓀多糖還原功能的探索還具有極大的空間。

4 展望

竹蓀在我國有著豐富的資源和悠久的歷史，其作為一種珍貴的食用菌，在食用、藥用、工業(yè)等方面均有廣泛的利用價值和全方位開發(fā)應(yīng)用前景，尤其在保健食品和中醫(yī)藥領(lǐng)域存在良好的應(yīng)用潛力。然而，我們看到竹蓀多糖在綜合利用方面還存在一些問題。竹蓀菌體價格較為昂貴，致使其研究和產(chǎn)業(yè)化成本較高，但科學(xué)研究大部分僅僅使用菌蓋或者子實體部分，而同樣含有多糖類物質(zhì)的菌托、菌柄則被視作廢棄物遺棄，造成大量自然資源浪費。下一步有關(guān)竹蓀多糖的科學(xué)研究應(yīng)集中在綜合利用竹蓀，提高產(chǎn)品附加值和探索改良提取竹蓀多糖相關(guān)工藝，提高產(chǎn)率，降低成本等方面，使竹蓀多糖相關(guān)研究真正應(yīng)用于人民生活。