載脂蛋白E基因多態性與缺血性腦卒中危險因素的相關性

茍東蕓,苑夢偉,高 雁,何 莎,李 漾, 李雯玉,馬曉偉,2,孫靜娜

(1.河北醫科大學第一醫院 神經內科,河北 石家莊,050031;2.河北省神經退行性疾病機制研究重點實驗室,河北 石家莊,050017;3.河北醫科大學,河北 石家莊,050017)

腦卒中是導致中國人群死亡的重要原因，其中缺血性腦卒中約占卒中總數的70%[1]。缺血性腦卒中是一種復雜的、受遺傳等多因素影響的疾病，不但發病率和病死率高，而且復發和殘疾的風險也很高[2]。研究[3-4]表明載脂蛋白E(ApoE)基因多態性等遺傳因素參與缺血性腦卒中的發生、治療和預后，ApoE基因多態性可能通過調節血脂水平影響動脈粥樣硬化和缺血性腦卒中的發生。與高加索地區人群相比，攜帶ε4等位基因的亞洲人群發生缺血性腦卒中的風險更高[5]。在中國人群中，研究[6-8]也證實ApoEε4等位基因攜帶者罹患缺血性腦卒中的風險更大。此外,ApoE基因多態性不僅與缺血性腦卒中密切相關，而且與其危險因素如高血壓、糖尿病[10]、冠狀動脈粥樣硬化[11]及高膽固醇血癥[12]等疾病也密切相關，較之ε2和ε3等位基因，ε4等位基因攜帶者發生上述疾病的風險明顯增高。

ApoE由人類19號染色體上的ApoE基因編碼，是一種主要在肝臟合成的多態性蛋白[13],在脂質運輸和代謝過程中發揮重要作用，參與多種疾病的發生和預后。ApoE基因有2個常見、非同義多態性位點526C>T和388T>C,二者形成3種等位基因[ε2(388T-526T)、ε3(388T-526C)、ε4(388C-526C)]及6種基因表型[14](ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4)。目前有關ApoE基因多態性的研究多集中在與阿爾茲海默病[15]、腦卒中[6]、糖尿病[6]等疾病相關性方面，目前有關河北地區ApoE基因多態性與缺血性腦卒中及其危險因素的相關研究較少。本研究采用聚合酶鏈式反應(PCR)-熒光探針法對河北地區缺血性腦卒中患者進行ApoE基因多態性檢測，并檢測卒中人群脂蛋白a[Lp(a)]、尿酸(UA)及血脂水平等，分析缺血性腦卒中患者ApoE基因多態性分布及其與缺血性腦卒中危險因素(如糖尿病、高血壓、高尿酸血癥、高血脂等)的相關性，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年10—12月河北醫科大學第一醫院神經內科門診就診的1 027例缺血性腦卒中患者為研究對象。缺血性腦卒中納入標準:① 年齡≥40歲者;② 缺血性腦卒中診斷參考《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[6]，腦CT或MRI檢查確認腦內有缺血性病變者。排除標準:① 近1個月內(通過確認患者的病歷)服用降脂藥物者;② 合并嚴重感染、腫瘤、嚴重的肝腎功能障礙和其他影響血脂的疾病者;③ 合并阿爾茨海默病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等疾病者。

為進一步分析ApoE基因多態性與缺血性腦卒中危險因素的相關性，篩選門診中住院的資料齊全的患者716例，將其分為3組，即ε2等位基因攜帶者(ε2/ε2、ε2/ε3)、ε3等位基因攜帶者(ε3/ε3)、ε4等位基因攜帶者(ε3/ε4、ε4/ε4)。排除ε2/ε4基因型(因其對血脂代謝的相反作用)。本研究經河北醫科大學第一醫院倫理委員會審批(批準號20190418),患者及其家屬對研究項目知情并簽署知情同意書。

1.2 儀器和試劑

PCR擴增儀及DNA提取儀:全自動核酸提純及熒光PCR分析儀Anadus9850(廈門安普利生物工程有限公司);人類SLCO1B1和ApoE基因多態性檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)(武漢友芝友醫療科技有限公司，批號19052008);血液基因組DNA提取試劑盒(廈門安普利生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 血液基因組DNA提取:抽取受試者空腹靜脈血2 mL置于EDTA抗凝管中，使用核酸提取試劑盒(廈門安普利生物工程有限公司)提取血液中的基因組DNA，嚴格按試劑盒說明書進行提取和檢測。

1.3.2 PCR反應體系和擴增條件:在2 μL待測樣本的基因組DNA(推薦濃度為5～15 ng/μL)、弱陽性對照和空白對照反應管中分別加入裝有23 μL SLCO1B1*lb、SLCO1B1*5、ApoE2、ApoE4的反應液，再進行PCR 擴增檢測。PCR反應條件:尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)處理階段為37 ℃下10 min,循環1次;預變性階段為95 ℃下5 min,循環1次;PCR階段為95℃下15 s、60 ℃下45 s,循環40次(設置在此階段結束時采集熒光信號)。

1.3.3 血液學指標檢測:于清晨抽取患者空腹靜脈血2 mL進行血液學指標檢測，采用Beckman LX20全自動血生化分析儀檢測UA、Lp(a)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平。高膽固醇血癥標準為TC≥5.72 mmol/L,HDL≤0.90 mmol/L,LDL-C≥3.64 mmol/L[17]。

1.4 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析,Hardy-Weinberg平衡采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗;采用方差分析或Wilcoxon秩和檢驗評估尿酸、Lp(a)、血脂等與ApoE基因多態性的關系;通過單因素和多因素Logistic回歸分析計算95%置信區間(CI)和優勢比(OR)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 河北地區缺血性腦卒中患者ApoE基因型和等位基因分布特點

河北地區缺血性腦卒中患者ApoE基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.87、0.27)。在漢族人群的6種ApoE基因型中,ε3/ε3型占69.52%,其余由高至低依次為ε2/ε3型(15.00%)、ε3/ε4型(12.46%)、ε2/ε4型(2.14%)、ε4/ε4型(0.49%)和ε2/ε2型(0.39%),ApoE基因型和等位基因在男性和女性患者中的分布差異無統計學意義(P=0.395、0.641)。見表1。

表1 缺血性腦卒中患者等位基因和基因型頻率分布[n(%)]

2.2 缺血性腦卒中患者的臨床特征及其與危險因素的相關性

ε2等位基因攜帶組、ε3等位基因攜帶組、ε4等位基因攜帶組的高血壓、糖尿病發生率及UA、同型半胱氨酸(Hcy)水平無差異，但3組Lp(a)、TG、LDL-C及高膽固醇血癥發生率比較，差異有統計學意義(P=0.003、0.042、0.019、0.013),表現為ε2等位基因攜帶者TG水平高于ε4等位基因攜帶者，而ε4等位基因攜帶者Lp(a)、LDL-C水平及高膽固醇血癥發生率高于ε2等位基因攜帶者。見表2、圖1。ε4等位基因攜帶組TC水平有升高趨勢,HDL-C水平有降低趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05);ε2等位基因攜帶組與ε3等位基因攜帶組TG、TC、LDL-C、HDL-C水平差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 ε2、ε3和ε4等位基因攜帶組患者臨床資料的比較[n(%)][M(P25,P75)]

2.3 ApoE基因多態性與高膽固醇血癥的相關性

為進一步探討ApoE基因多態性與高膽固醇血癥的關系，以高膽固醇血癥為因變量,ApoE基因型及臨床指標為自變量，進行單因素Logistic回歸分析，各項變量賦值見表3。結果顯示,ApoE ε4等位基因(OR=1.924,95%CI為1.235～2.997,P=0.004)、糖尿病(OR=1.963,95%CI為1.367～2.820,P<0.001)是高膽固醇血癥發生的危險因素，見表4。

表3 高膽固醇相關危險因素的變量賦值表

表4 高膽固醇血癥相關危險因素的單因素Logistic回歸分析

在校正單因素回歸分析中P<0.10的因素后，將年齡、ε4等位基因、糖尿病、體質量指數(BMI)納入多因素回歸方程中，使用前進法分析，結果發現以ε3/ε3基因型為參照,ApoEε4等位基因與高膽固醇血癥的風險增加相關(OR=1.943,95%CI為1.240～3.043)。見表5。回歸分析的Hosmer-Lymeshaw檢驗顯示,χ2=12.171、P=0.144,表明該模型與原始數據吻合良好。

表5 高膽固醇血癥危險因素的多因素逐步法Logistic回歸分析

3 討 論

ApoE基因多態性的分布在不同種族間存在差異。本研究中，缺血性腦卒中患者中ε3/ε3基因型比率最高(69.52%),而ε2/ε2基因型比率最低(0.39%),與河北地區[18]、華中地區[19]和南部地區[20]數據相似。在等位基因分布數據方面，河北地區缺血性腦卒中患者ε2等位基因頻率(8.96%)略低于健康(9.4%)或無缺血性腦卒中(6.51%～19.40%)[2,7,21]的中國人群,ε4等位基因頻率(7.79%)亦低于既往研究[2,3,7,22]報告的數據。本研究還發現,ApoE等位基因頻率與既往研究[23]報道的白種人等位基因頻率差異較大，后者ε4、ε2、ε3的等位基因頻率分別為15%、8%和77%。這提示不同種族和地區間ApoE基因多態性分布存在明顯的差異。作者分析本研究與既往中國人群報道存在差異的原因為:本研究對納入患者進行了詳細的篩選，排除了合并有嚴重認知功能障礙、冠心病等與ε4等位基因比率升高密切相關的疾病，更準確地反映了ε4等位基因在缺血性腦卒中人群中的分布特征。

ApoE基因多態性與缺血性腦卒中相關，但ApoE是對缺血性腦卒中有直接影響，還是通過影響其危險因素進而間接影響疾病的發生，目前尚無定論。本研究針對缺血性腦卒中人群，分析了ApoE與其危險因素(如高血壓、糖尿病、高UA、高Hcy、高膽固醇血癥等)的相關性，結果并未發現ApoE基因多態性與高血壓、糖尿病等疾病的發生率具有相關性。本研究發現ε4等位基因攜帶者高膽固醇血癥的發病率及Lp(a)、LDL-C水平顯著增高，考慮到ApoE基因多態性可顯著影響脂質代謝，而脂質異常代謝又會造成膽固醇水平升高，不僅使患者罹患缺血性腦卒中的風險升高，也增加了高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病等相關危險因素的發生風險，從而進一步影響腦卒中的發生。

本研究進行了單因素和多因素回歸分析，發現在調整年齡、BMI、糖尿病和ApoE基因型后,ε4等位基因增加了患者罹患高膽固醇血癥的風險;與ε3/ε3基因型相比,ε4等位基因使缺血性腦卒中患者發生高膽固醇血癥的風險增加了1.943倍(OR=1.943,95%CI為1.240～3.043),這也與既往研究[12,24]相似。上述結果提示，無論是通過影響高血壓、冠狀動脈粥樣硬化、高膽固醇血癥等危險因素，還是對其產生直接影響,ApoE基因多態性對缺血性腦卒中的影響都與血脂代謝紊亂這一環節緊密相連,ApoE基因多態性作為脂質代謝的重要影響因素，對缺血性腦卒中的發生產生一定的影響。

因此，對于攜帶ε4等位基因的缺血性腦卒中患者，應鼓勵其控制膽固醇攝入量，堅持少食多餐的原則，倡導良好的生活方式，戒煙和限酒，并進行適當的活動。此外，本研究也發現ε2等位基因攜帶者TG水平偏高，建議患者在滿足日常基本營養需求的基礎上，控制總能量的攝入，合理搭配各營養元素的組成比例，控制體質量，戒煙限酒，并堅持定期中強度代謝運動[25],從而維持體內血脂水平的穩定，預防高膽固醇血癥及缺血性腦卒中等疾病的發生。