四川引種的“不知火”柑橘皮主要有效成分分析

江延玉，嚴敏文，張西玉，范 晶，伏秦超

（樂山師范學院生命科學學院，四川樂山 614000）

“不知火”柑橘又稱“凸橘”“丑橘”，是日本農(nóng)水省園藝試驗場于1972 年以“清見”與“中野3 號”椪柑雜交育成[1]，2000 年引入我國四川種植，主要集中在成都、眉山、樂山等地栽培。目前，“不知火”柑橘主要用于鮮果銷售和果肉榨汁。柑橘皮富含黃酮類、維生素、香精油、果膠、纖維素、色素和橙皮苷等多種有效成分，但有效利用不足[2-3]。1）橘皮里的果膠非常穩(wěn)定，具有增稠和膠凝特性[4]，可以用作膠凝劑、增稠劑、乳化劑和佐劑[5]，同時具有抗菌消炎和抗癌等作用。2）橘皮含有非常豐富的精油成分，是提取精油的原料之一，以D-檸檬烯為主，精油不僅用途廣泛，而且具有抑菌殺菌、抗氧化活性和抗腫瘤細胞活性等作用[6]。在食物和動物飼料中加入柑橘皮精油，既可殺死食源性病原體，又可防止食品變質(zhì)[7]。3）橘皮中的類黃酮和酚酸具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗心血管、解毒護肝和抑制癌細胞生長等藥理作用[8-9]。

“不知火”橘皮具有果皮厚實的特點，經(jīng)測定，橘皮可占整果重量30%。目前，尚未有關“不知火”橘皮中有效成分的研究報道，故本研究基于對柑橘皮活性成分的已有研究，分別通過酸水解法、水蒸氣蒸餾法和溶劑萃取法測定四川樂山、眉山、成都等地“不知火”柑橘皮的果膠、精油和黃酮的含量，為“不知火”開發(fā)運用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

“不知火”樣品分別購于四川省樂山市井研縣、眉山市丹棱縣、成都市蒲江縣，購得后保存在貼好標簽的密封袋中，放置在4 ℃條件的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗方法

1.2.1 果膠的制備（酸水解法）

1.2.1.1 原料預處理

稱取預先制備的“不知火”干燥果皮樣品各16 g，加入240 mL 的水，并置于90 ℃的水浴中5～10 min，使酶失活以防止果膠分解，將其用紗布過濾，取出果皮，用水洗滌并切成3～5 mm 的大小。然后用50～60 ℃的溫水沖洗果皮，每次沖洗后，用紗布擠壓果皮，重復上述步驟，漂洗。至果皮無色無異味即可[9-10]。

1.2.1.2 酸水解提取果膠

將預處理過的果皮顆入燒杯中，加入0.2 mol·L-1鹽酸浸泡，將溶液的pH 值調(diào)節(jié)在2.0～2.5，并置于90 ℃數(shù)顯恒溫水浴中40 min。期間繼續(xù)用玻璃棒攪拌。趁熱用布氏漏斗過濾，將濾渣用清水洗滌直至粘度消失，然后將濾液和洗滌液合并以獲得水溶性果膠提取物。

1.2.1.3 脫色

向所獲濾液中加入了少量活性炭，并在80 ℃下加熱20 min以使其脫色和除味。

1.2.1.4 沉淀

用冰袋圍住盛有過濾后所得溶液的燒杯，迅速冷卻，用6 mol·L-1冷稀氨水將pH 值調(diào)至3～4，并用玻璃棒連續(xù)攪拌。然后緩慢加入原始濾液體積的1.5 倍的95%的乙醇溶液，靜置至絮凝物產(chǎn)生時，用尼龍布過濾以獲得濕果膠。

1.2.1.5 過濾、洗滌、干燥

向濕果膠中加入30 mL 的無水乙醇洗滌，過濾并用尼龍布擠壓。將脫水的果膠放入表面皿中，攤開放入60～70 ℃的電熱恒溫鼓風干燥箱中干燥，然后壓碎成果膠。

1.2.1.6 果膠產(chǎn)率計算

果膠的產(chǎn)率根據(jù)等式(1)計算。

公式(1)中：W—果膠得率，%；m1—成品果膠質(zhì)量，g；m2—果皮粉質(zhì)量，g。

1.2.2 精油提取方法（水蒸氣蒸餾法）

1.2.2.1 原料預處理

使用粉碎機將干燥后的“不知火”柑橘皮樣品粉碎至粉末狀，各稱取干果皮20 g放置于500 mL蒸餾瓶中，加入蒸餾水200 mL 作為提取劑[物料、液體的比例為1∶10 (g·mL-1)]，并加入NaCl 0.3 g 作為提取助劑，利用水蒸氣蒸餾裝置提取2.5 h 后收集餾出液[11-12]。經(jīng)靜置、離心后得精油成品。若收集到的精油中含有少許水分，可加入適當?shù)臒o水硫酸鈉脫水后稱量，再計算精油得率。

1.2.2.2 精油出油率計算

柑橘出油率采用直接稱重法計算，計算公式見公式(2)。

出油率(%)=精油產(chǎn)品質(zhì)量(g)/“不知火”果皮干重

1.2.3 黃酮提取方法（溶劑提取法）

1.2.3.1 蘆丁標準曲線

取0.1 g·mL-1的蘆丁標準溶液，然后在6 個10 mL帶有塞子的試管中，分別對應加入蘆丁標準溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL。在每個試管中分別加入30%乙醇5 mL 和0.3 mL 的5% NaNO2溶液，搖勻靜置6 min。然后再加入0.3 mL10%的Al2(SO4)3溶液并放置6 min。加入4%NaOH溶液4 mL，搖勻后用蒸餾水定容至10 mL，靜置20 min。510 nm測出蘆丁標準溶劑溶液的吸光度，重復3 次[10,13-14]，實驗結果見表1。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)求出實驗的回歸方程和相關系數(shù)，所得結果如圖1 所示。實驗中獲得的標準回歸方程見公式(3)。

圖1 蘆丁標準曲線圖

表1 蘆丁溶液與其分光光度計測定的吸光度的關系

公式(3)中：Y—吸光度，A；X—標準溶液濃度，mg·mL-1；相關系數(shù)R2為0.999 6。

回歸方程見公式(4)。

公式(4)中：Y—吸光度（A）；X—標準溶液濃度，mg·mL-1。

1.2.3.2 黃酮樣品制備

稱取干燥后“不知火”柑橘皮樣品粉末各1 g，加入70%乙醇25 mL，分別置于100 mL 燒瓶中，并固定在恒溫水浴鍋（70 ℃）中2 h。震蕩后取抽濾，留下第1次濾液。濾渣進行第2次浸提，取出過濾，合并2次濾液，再次加入70%乙醇并至100 mL，將所得的溶液放于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.3 樣品黃酮測定

準確量取各“不知火”黃酮樣品溶液5 mL，分別加入0.3 mL 的5%NaNO2搖動6 min，然后加入0.3 mL的10%的Al(NO3)3，混勻后放置6 min，然后再加入4%NaOH（現(xiàn)配）溶液4 mL，最后加入蒸餾水定容至10 mL，震蕩后靜置20 min。在510 nm 處測量吸光度，根據(jù)標準曲線計算樣品中的類黃酮含量，并重復實驗3次取平均值。

1.2.3.4 黃酮含量計算

黃酮含量計算公式見公式(5)。

公式(5)中：A—樣品的吸光度；C—提取物中黃酮的濃度。

公式(6)中：E—總黃酮的含量，mg·g-1；C—提取物中黃酮的濃度，g·mL-1；V—體積，mL；n—稀釋倍數(shù)；m—所用樣品的重量，g[15]。

2 結果與分析

2.1 “不知火”柑橘皮中果膠得率測定結果

根據(jù)測驗方法進行3次重復實驗，測得“不知火”橘皮果膠含量見表2，其中樂山“不知火”橘皮果膠得率為18.13%，眉山“不知火”橘皮果膠得率為17.31%，成都“不知火”橘皮果膠得率為9.43%，平均果膠得率為14.96%。

表2 “不知火”柑橘皮中果膠測定結果（酸水解法）

2.2 “不知火”柑橘皮中精油得率測定結果

根據(jù)測驗方法進行3次重復實驗，測得“不知火”橘皮精油含量見表3，其中樂山“不知火”橘皮精油得率為3.50%，眉山“不知火”橘皮精油得率為2.00%，成都“不知火”橘皮精油得率為1.75%，平均橘皮精油得率為2.42%。

表3 “不知火”柑橘皮中精油測定結果（水蒸氣蒸餾法）

2.3 “不知火”柑橘皮中黃酮測定結果

根據(jù)測驗方法進行3 次重復行實驗，測得“不知火”橘皮黃酮含量，其中樂山“不知火”橘皮黃酮含量為0.45 mg·g-1，眉山“不知火”橘皮黃酮含量為0.28 mg·g-1，成都“不知火”橘皮黃酮含量為0.24 mg·g-1，平均黃酮含量為0.32 mg·g-1。

表4 “不知火”柑橘皮中總黃酮測定結果（溶劑提取法）

3 小結與討論

“不知火”柑橘因其奇特的果實外形，脆甜帶點微酸的口感，個性化的外觀和別具一格的風味成為其銷售的亮點。又因其具有豐產(chǎn)性及與“椪柑”相當?shù)哪秃栽谒拇ㄊ〉玫酱竺娣e種植[16-17]，大范圍的種植需要加大對副產(chǎn)物柑橘皮渣的利用，目前對柑橘果皮的處理，主要有曬干入藥和廢棄，而并沒有物盡其用。多個研究表明，果膠、精油、黃酮等化合物廣泛存在于柑橘皮渣中且具有極大的開發(fā)利用價值[5]。果膠是一種植物多聚糖，是細胞壁的主要成分之一，作為天然的食品加入劑，它在食品、制藥行業(yè)中扮演著不可替代的角色。此外，橘皮中所含的黃酮類化合物是許多中草藥的有效成分，具有降低血糖血脂、抗氧化、調(diào)理腸道微生物和消化酶活性以此促進消化等多種生理功能，這些性質(zhì)賦予它極高的食用和藥用價值。為此，各國政府和醫(yī)藥、食品等行業(yè)都對它給予高度重視和熱切關注。

本研究結果顯示，樂山、眉山、成都3 個地區(qū)的“不知火”柑橘皮中均含有豐富的果膠、精油和黃酮，但各有效成分含量因產(chǎn)地不同存在差異。在果膠得率方面，樂山和眉山果膠得率接近，成都的果膠得率最低，平均果膠得率為14.96%，造成差異的原因可能與氣候、地勢、土質(zhì)及栽培方式不同有關，同時總體果膠得率較低[10]，可能因為“不知火”柑橘皮果膠提取工藝有待進一步優(yōu)化。在精油提取方面，由于采取的是水蒸氣蒸餾法而非壓榨法，使得實驗所得精油為透明澄清液體，還夾雜淡淡的橘皮清香，這表明通過蒸汽蒸餾提取的精油具有良好的外觀、顏色和氣味，且精油的產(chǎn)率也相對較高，一般柑橘皮精油出油率為1.2%～1.6%，而由“不知火”柑橘皮提取出的精油高達2.42%。本實驗采取溶劑提取法提取柑橘皮總黃酮，與超聲波輔助法、堿法提取等相比[18]，其方法簡單，設備要求低，是目前常用的柑橘皮黃酮提取方法，本實驗測得樂山“不知火”橘皮黃酮含量為0.45 mg·g-1，眉山“不知火”橘皮黃酮含量為0.28 mg·g-1，成都“不知火”橘皮黃酮含量為0.24 mg·g-1，平均黃酮含量為0.32 mg·g-1，存在一定的地區(qū)差異性。

全面利用柑橘各個部位，特別是原本作為廢棄物的果皮渣，這不僅可以提高經(jīng)濟效益，還可以促進資源循環(huán)利用，為環(huán)境保護做了相應貢獻，減少污染，因而具有良好的市場開發(fā)前景。本研究為綜合開發(fā)和利用“不知火”柑橘皮的有效成分，獲得更大的經(jīng)濟效益和社會效益提供了理論基礎。