微膠囊化生姜、枸杞、梔子提取物的ACE抑制率、苦味及穩定性研究

朱啟鵬，李曉東，劉 璐，陸欣宇，周星宇，唐雅倩，高銅韓

（東北農業大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030）

近年來，藥食同源材料因其具有安全性高、效果好的特點日益受到食品研究者的重視。其中生姜、枸杞、梔子作為常見的藥食同源材料，具有抗氧化、降血壓等多種生物活性，在功能性食品方面有很大的應用潛力。生姜中含有多種酚類、黃酮類功能性成分。姜黃素是從生姜中提取出的一種植物多酚，具有抗氧化、降血壓的活性[1-2]。研究發現姜黃素可以降低血漿及腎組織ET-1的含量[3]，證明其作為多酚化合物具有類似ACE抑制肽的降血壓作用。枸杞中含有20余種氨基酸，其醇提物具有很強的降血壓作用，且劑量效應關系顯著[4]。梔子中分離和鑒定出的活性化合物有40多種，包括環烯醚萜類、黃酮類、有機酸酯類、甾醇類及色素等，通過改善內皮功能調節血壓[5-7]。同時研究表明，姜和梔子混合后與單一梔子相比較，其中梔子苷、蘆丁等成分含量顯著上升[8]。但由于它們所含的活性成分穩定性差，容易受環境的影響，其降血壓活性會遭受破壞[9]，同時苦味等問題也嚴重影響其在食品加工中的應用。目前提高穩定性的方法主要是使用微膠囊技術進行包埋。微膠囊可以保護活性物質，使其不被外界環境影響，從而提高了產品穩定性。

在微膠囊制備的過程中，包埋壁材的選擇對最終產品的應用最為重要。常用的壁材有糖類、糊精類、纖維素類、蛋白類等[10-11]，在實際應用中，為了達到更好的效果，有時候選用兩種以上的材料復合進行包埋[12]。莊建鵬等[13]利用乳清濃縮蛋白和麥芽糊精為壁材，對乳清蛋白水解物進行包埋，得到了降膽固醇活性良好的產品。陳程莉[14]將改性淀粉復合阿拉伯樹膠制備出黑枸杞花青素的微膠囊，提高了花青素的抗氧化能力。李秀等[15]以β-環糊精為壁材包埋枸杞葉黃酮提取物，改善了其溶解性和穩定性。Jla等[16]以阿拉伯樹膠、海藻酸鈉和殼聚糖為復合壁材，對姜黃素進行包埋，克服了其在存儲加工過程中的降解問題。李雨田等[17]發現梔子與姜復合后的環烯醚萜苷類成分成分含量有所升高，抗氧化能力提升。目前，研究主要集中在對單一生姜、枸杞、梔子提取物的微膠囊化，但三種藥材復合后的成分更加復雜，對于包埋壁材的要求更高，對生姜、枸杞、梔子混合提取物的微膠囊化研究仍然較少，如何能最大程度的保護好其降血壓活性成分是一個挑戰。

本文將生姜、枸杞、梔子進行濃縮提取，制備混合提取液后，以麥芽糊精、變性淀粉以及兩者質量比1:1混合分別與明膠作為復合包埋材料，對三種藥食同源提取物進行包埋，經噴霧干燥后制成微膠囊，對微膠囊的理化性質、形態結構以及穩定性進行研究分析，比較篩選出最佳包埋壁材，為生姜、枸杞、梔子提取物在食品工業中的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生姜、枸杞、梔子 西安國豪生物有限公司；明膠、變性淀粉、麥芽糊精 廣州成碩生化試劑有限公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、沒食子酸標準品西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；胰蛋白酶（3000 U/mg） 北京索萊寶科技有限公司；胃蛋白酶（3000 U/mg） 西安康諾化工有限公司；HCl、NaCl、Na2CO3、無水乙醇、磷酸、磷酸二氫鉀、鎢酸鈉、碳酸鈉、鉬酸鈉、溴化鉀等 均為分析級，上海國藥集團化學試劑有限公司。

XZ-10 DTD超聲波清洗機 新芝生物科技有限公司；BL-6000Y噴霧干燥機 上海比朗儀器制造有限公司；S3400-N掃描電子顯微鏡 日本日立公司；VERTX 70型傅立葉變換紅外光譜儀 德國BRUKER公司；Pyris 1 TGA型熱重分析儀 美國PERKINELMER公司；T6新世紀紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生姜、枸杞、梔子濃縮提取液的制備 分別取生姜、枸杞、梔子原料粉碎后，過100目篩備用。采用超聲波輔助浸提法，根據李小多等[18]的試驗方法進行改進，以50%濃度乙醇為提取液進行浸提。將三種粉末分別與乙醇溶液混合均勻，震蕩1 min后開始浸提。超聲最佳條件確定為：料液比15:1（g/mL），超聲溫度50 ℃，超聲時間1 h，超聲功率100 W。超聲完成后冷卻至室溫，在5000 r/min下離心10 min，取上清液。同時根據前期試驗結果，生姜、枸杞、梔子提取液混合比確定為生姜:枸杞:梔子=1:2:1（v/v/v）。

1.2.2 微膠囊的制備 制備方法參考陳程莉[14]、黃曉梅等[19]的進行修改，稱量20 mL配好的原料濃縮液，按照芯壁比1:5（w/w）進行包埋，溶于100 mL溫水中，壁材分別為2%麥芽糊精、2%變性淀粉、1%麥芽糊精和1%變性淀粉混合，同時壁材均混合1%明膠，配成120 mL混合液，經高速離心機在10000 r/min條件下高速均質乳化10 min后，進行噴霧干燥生產。進風溫度設置為180 ℃，出口溫度設置為80 ℃，進料流速設置為10 mL/min。

取上步配好的原料濃縮液，不加任何壁材直接進行噴霧干燥生產得到的微膠囊作為空白樣品。

1.2.3 包埋率的測定 包埋率的計算參考Khashayar等[20]和王曉陽[21]的方法，準確稱取1 g微膠囊產品，加入10 ml蒸餾水，再加入100 mL無水乙醇，靜置3 min。在20 ℃，5000 r/min下離心5 min，用0.45 μm濾膜過濾獲得上清液。以沒食子酸作為標準曲線，用Folin-Ciocalteu比色法測定濾液中多酚含量，即為總酚類含量。準確稱取1 g微膠囊產品，加入100 mL無水乙醇，旋渦震蕩10 s后靜置，在20 ℃，5000 r/min下離心5 min，用0.45 μm濾膜過濾獲得上清液，測定濾液中多酚含量即為表面酚類含量。計算方式如下：

式中：W1：總酚類含量，mg；W2：表面酚類含量，mg。

1.2.4 苦味的評價 利用風味稀釋分析法（TDA）對樣品進行苦味評價。參考楊抒等[22]的方法，將各樣品配成濃度為5%（w/w）的溶液，未包埋組為空白組，以原料濃縮液和各類壁材在相同配比和濃度下進行機械混合的溶液作為機械攪拌組，用去離子水對樣品溶液進行1:1梯度稀釋。稀釋后的各樣品溶液隨機編號，由低濃度到高濃度依次給評價小組。共有20位感官評價員參與評分。感官評價進行三次平行實驗。苦味越強，分值越高。風味稀釋值（TD）為能夠分辨出樣品和空白組的苦味差異的最大稀釋倍數。將樣品分別按照2、4、8、16、32倍進行梯度稀釋，以分辨出樣品與空白組間明顯苦味差異時的最大稀釋倍數為TD值。TD值滿分32，TD值越高，則說明樣品苦味越重。

1.2.5 水分含量的測定 將精確稱量的1 g粉末放入先前干燥并稱重的培養皿中，然后放入烘箱中（在105±2 ℃下12 h），直至達到穩定的重量。根據干燥前后的重量損失計算水分含量。

1.2.6 吸濕性測定 產品的吸濕性是評價產品穩定性的重要指標。方法參考黃曉梅等[19]，取1 g微膠囊粉末樣品置于干燥器中，在25 ℃下，置于裝有飽和NaCl溶液（75% RH）的氣密塑料容器中。7 d后對樣品稱重，吸濕性計算公式如下：

式中：M1：樣品吸濕后質量，mg；M2：樣品初始質量，mg。

1.2.7 微膠囊微觀結構 微膠囊的微觀結構通過掃描電子顯微鏡進行觀察。將一層雙面膠貼于掃描電鏡樣品臺上，微膠囊粉末充分混合均勻后撒在雙面膠上，稍加用力壓實，噴灑一層薄金后用掃描電鏡觀察微膠囊的微觀形貌。測量條件：電壓設置為5 kV，放大倍數3000倍。

1.2.8 紅外光譜分析 分別稱取2 mg微膠囊粉末、變性淀粉、麥芽糊精、明膠以及未包埋的中藥粉，加入100 mg溴化鉀（105 ℃烘干），研磨均勻后壓片，使用傅里葉紅外光譜儀進行掃描并進行紅外光譜分析。掃描范圍4000～500 cm-1，光譜分辨率1 cm-1，掃描次數32次。

1.2.9 熱穩定性測定 用熱重分析儀分析麥芽糊精、變性淀粉以及混合壁材制備微膠囊粉末的熱穩定性差異。稱取各樣品10 mg，測定條件：氮氣流速率30 mL/min，測定范圍30～500 ℃，升溫速率10 ℃/min。

1.2.10 微膠囊體外釋放試驗

1.2.10.1 模擬胃液、腸液的配制 模擬胃液（SGF）和模擬腸液（SIF）的配制方法參考王靜等[23]的方法。

模擬胃液：準確稱取0.20 g NaCl溶于70 mL超純水中，用1 mol/L HCl溶液調節溶液至pH為5.0，加水定容至100 mL，再加入0.45 g胃蛋白酶（比活力1:3000）和0.03 g脂肪酶（50 U/mg），在恒溫37 ℃下以10 r/min磁力攪拌10 min，將溶液混勻。

模擬腸液：準確稱取0.68 g K2HPO3溶于超純水中，用1 mol/L HCl溶液調節溶液至pH為6.8，加水定容至100 mL，再加入0.12 g的膽鹽和0.10 g胰酶，恒溫37 ℃下以10 r/min磁力攪拌10 min，使溶液混勻。

1.2.10.2 釋放度的測定 參考羅麗娟[24]的方法并完善操作如下。

取1.0 g各微膠囊粉末加入到500 mL 37 ℃的模擬胃液中混合均勻，每隔0.5 h取樣1次，取樣體積5 mL同時補加模擬胃液5 mL，測定其酚類含量。釋放率計算公式如下：

式中：M3：模擬胃液中酚類的釋放量，mg；M4：微膠囊中酚總量，mg。

將在上述模擬胃液中作用后的微膠囊粉末，在3000 r/min下離心5 min，水洗之后再次加入到500 mL 37 ℃的模擬腸液中混勻，每隔5 min取樣1次，方法同上，測定其酚類含量。釋放率計算公式（4）如下：

式中：M5：模擬腸液中酚類的釋放量，mg。

1.2.10.3 ACE抑制率的測定 采用酶標儀法對ACE抑制率進行測定，根據陳琨[25]的方法進行改善，操作如下。

緩沖液的配制：稱取HEPES 1.91 g和NaCl 1.75 g，加適量的蒸餾水，攪拌至將其完全溶解后，調節溶液pH至8.3，定容至100 mL，于4 ℃保存備用。

FAPGG的配制：稱取19.97 mg FAPGG，加緩沖溶液溶解并定容至50 mL，于4 ℃避光保存備用。使用前37 ℃預熱15 min。

樣品的配制：噴霧干燥粉用緩沖液配成相應濃度。

ACE用去離子水配成0.1 U/mL。

ACE抑制率的測定：對照孔為20 μL ACE加40 μL HEPES緩沖液加50 μL FAPGG。樣品孔為20 μL ACE加40 μL樣品加50 μL FAPGG。在340 nm波長下，分別測定對照孔和樣品孔的初始吸光度（a1和b1），酶標板于37 ℃條件下保溫30 min后再測定其吸光度（a2和b2），每個樣品測定3次重復。對照孔的吸光度減少值A=a1-a2，樣品孔的吸光度減少值B=b1-b2。樣品ACE抑制率的計算公式如下：

1.3 數據處理

采用Origin 9.0軟件進行制圖，采用軟件SPSS 22.0對3次平行實驗的數據進行顯著性分析（P＜0.05表示差異顯著）和相關性分析。所有實驗重復3次以上。

2 結果與分析

2.1 不同壁材的包埋效果

由表1可知，不同包埋壁材對活性成分保護是有影響的。其中混合壁材包埋率最高為75.24%，較單一麥芽糊精、變性淀粉分別顯著高出3.56、6.17個百分點（P＜0.05）。包埋率的順序依次為：混合壁材＞單一麥芽糊精＞單一變性淀粉。同時總酚含量是評價中藥材提取物降血壓能力的指標之一[26]，微膠囊化后包埋的酚類物質含量均在7.33～9.61 mg/g，與總酚類含量相比損失較小，證明包埋效果顯著。因為在噴霧干燥時，顆粒周圍會迅速形成薄膜，因此酚類大部分會保留在載體的結構中。這與Tolun等[27]的結論相似，其研究在不同芯壁比各類壁材對水果中酚類化合物生物活性包埋影響，發現以麥芽糊精和阿拉伯膠為混合壁材制備的微膠囊的包埋率最高，這是因為多酚類對理化因素非常敏感，需要多重保護。

表1 不同壁材制備的微膠囊包埋效果Table 1 Embedding effect of microcapsule prepared from different wall materials

2.2 微膠囊的理化性質

壁材種類對微膠囊的苦味、水分含量、吸濕性的影響如圖1所示。用風味稀釋分析法（TD值）表征產品苦味的結果見圖1A。未包埋的提取物苦味最強烈，TD值為32。三種壁材與提取物機械混合后溶液TD值均降為16。經過噴霧干燥微膠囊化處理后，單一麥芽糊精和變性淀粉包埋的提取物TD值降為8。而混合壁材制備的樣品苦味下降最低，TD值為4。結果表明，噴霧干燥制備比機械混合更能降低其苦味（P＜0.05）。這是因為微膠囊化后顆粒更均勻，更大程度的阻止了酚類中的黃酮類物質與味蕾的接觸，有效地降低了中藥材提取物的苦味[28]。

由圖1B可知，在相同的噴霧干燥條件下，經過包埋的中藥粉，其含水量都有所下降。其中麥芽糊精和混合壁材包埋后含水量下降最多，分別為2.88%、2.94%，較未包埋樣品顯著下降了0.75%、0.69%（P＜0.05）。由于變性淀粉具有較高的持水力，所以麥芽糊精更能降低產品的含水量。而未包埋的中藥粉，因為其中酚類是親水性的，所以經過噴霧干燥后依然有較高的含水量[20]。

圖1 壁材種類對微膠囊苦味（A）、水分含量（B）與吸濕性（C）的影響Fig.1 Effects of wall material types on microcapsule bitter taste(A), moisture content(B) and hygroscopicity(C)

吸濕性是指粉末從周圍環境中吸收水分的能力，它影響噴霧干燥粉末的穩定性和保質期。從圖1C中看出，7 d后，未包埋的樣品吸濕性顯著提高至52.83%（P＜0.05）。而包埋過的樣品吸濕性變化不大。推測這在一定程度上與包埋率有關，包埋率越高，吸濕性越低（P＜0.05）。其中混合壁材的包埋率最高，所以吸濕性最低，為16.04%。Poonam等[29]的研究結果表明，微膠囊化可以阻止酚類等活性物質與空氣中水分的直接接觸，其中入口溫度和壁材種類對含水量和吸濕性影響最大。

2.3 微膠囊形態的觀察

由圖2可知，在不同壁材的包埋下，微膠囊粉末展現出了不同的形態。在以單一麥芽糊精為壁材進行包埋時，其表面凹陷很多，這可能是噴霧干燥過程中，由于瞬間高溫導致溶液液滴蒸發過快瞬間失水導致[30]。這是噴霧干燥制備微膠囊的特點。放大觀察后能看到其呈不規則狀且大小不一，可能是溶液從高壓噴槍中射出時不穩定[20]。而以單一變性淀粉為壁材進行包埋時，其裂縫、孔洞較多且微膠囊較為分散。可能是變性淀粉遇水高溫加熱后形成了輕微糊狀結構，不僅降低噴霧干燥效率，還產生了表面裂紋[27]。在混合壁材包埋下大部分粉末顆粒呈連續、球形結構。相較于單一壁材的微膠囊，其形狀較為均勻完整，包埋效果明顯。證明復合壁材比單一壁材具有更能保護酚類物質，提高微膠囊的穩定性。其中較大的圓球形顆粒可能是多個變性淀粉顆粒被明膠吸附，形成了更大的結構[31]。使用復合壁材制備的微膠囊樣品，物理性質得到改善，內部成分均勻分布。根據Khashayar等[20]的研究可知，由于多糖與酚類直接的作用，抑制了分子間的聚集，為酚類提供了空間穩定性。所以，以混合壁材進行包埋是最有效的。

圖2 不同壁材的中藥提取物微膠囊粉末掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron microscopy(SEM) of microcapsules of Chinese herbal extracts from different wall materials

2.4 紅外光譜分析

不同壁材包埋的提取物微膠囊粉末以及不同壁材的紅外光譜如圖3所示。在900～1700 cm-1區域內，主要是酚類有關的峰。在2800～3700 cm-1區域內，主要是羥基、羧酸有關的峰[32]。從圖3A中看到，未包埋的粉末在1637 cm-1的峰對應著多酚結構中苯環的C=C的伸縮振動，這可能是花青素的骨架，在壁材包裹后偏移為1654 cm-1[33]。同時在1154和931 cm-1代表C-O、C-H的峰消失，表明微膠囊化過程中酚類提取物被壁材覆蓋，且混合壁材包埋的效果更好。2928 cm-1處的峰為-CH2，可能是C-H拉伸振動引起，而1654 cm-1處的峰與C-C拉伸有關[34]。通過比較包埋前后的吸收峰特征差異，在混合壁材的紅外光譜圖中，酚類的各吸收峰強度減弱程度最大，證明其被包裹的效果最好，活性成分完全進入微膠囊的內腔[35]。

圖3 B展示了不同壁材的紅外光譜圖，在純麥芽糊精結構中，在1019 cm-1處的峰是=CH和=CH2鍵的角變形、846 cm-1的峰是-CH2和C-H的變形、760 cm-1處的峰是吡喃糖環的結構狀態[14]。此外，麥芽糊精在1654 cm-1的峰主要與碳水化合物的-OH基團的氫鍵有關。變性淀粉在3416 cm-1處為-OH的吸收帶，在2931 cm-1處的尖峰可能與C-H的拉伸有關。明膠在1663 cm-1處是酰胺I帶，在1088 cm-1處是酰胺Ⅲ帶[36]。同時對比圖3A和圖3B，在包埋后的樣品中也能觀察到壁材的所有峰，證明噴霧干燥的過程沒有導致麥芽糊精、變性淀粉、明膠與中藥提取物成分之間產生新的鍵。

圖3 不同粉末的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of different powders

2.5 熱穩定性

通過熱重分析可以比較出不同壁材微膠囊之間的熱穩定性差異[37]。圖4是三種壁材的熱重曲線，可以看到微膠囊的分解過程大概是四個階段。在30～100 ℃各微膠囊的質量損失率都在7%左右，主要是由自由水蒸發引起的；在100～180 ℃質量損失率下降減緩，均在12%左右，主要是結合水和揮發性物質的損失[38]；在180～350 ℃失重加快，此時混合壁材保護效果顯著優于其它，壁材和酚類都開始分解失重，導致大量中間產物產生，三種壁材損失率分別為在60%、58%、55%；在350 ℃以上，隨著溫度升高各物質完全氧化分解，損失率趨于穩定。在180 ℃以下時各壁材包埋的中藥粉微膠囊質量損失均很少，證明其能滿足正常食品的加工及儲存條件。而混合壁材包埋的微膠囊在180 ℃以上時顯著優于單一壁材的包埋。陳程莉[14]以單一變性淀粉作壁材包埋黑枸杞花青素，微膠囊在133.52 ℃處即受熱分解。本研究中混合壁材制備的微膠囊受熱分解約在180 ℃處，顯著高于單一壁材。趙婕等[39]以阿拉伯膠和麥芽糊精為復合壁材包埋薏米糠油，結果也顯示出混合壁材具有更好的熱穩定性，略高于本研究中混合壁材微膠囊。這可能是混合壁材相對于界面可以形成彈性更高的膜，經過高溫后水分蒸發、表面硬化，結構更致密，分解更難，所以擁有更好的熱穩定性[38]。

圖4 不同壁材微膠囊的熱重曲線Fig.4 Thermogravimetric curves of microcapsules with different wall materials

2.6 微膠囊的釋放率及ACE抑制率

隨著時間的延長，提取物中酚類的釋放率從迅速增長逐漸趨于穩定。如圖5所示，在模擬胃液中，到180 min時，最終釋放率穩定在36.64%。釋放率排序依次為：變性淀粉＞麥芽糊精＞混合（P＜0.05），可能是偏酸性環境會使淀粉分子酸解而失去增稠和穩定能力，而混合壁材的保護效果更佳[40]。且停留時間越長，微膠囊的破壞情況越嚴重。在模擬腸液中，微膠囊進一步分解，至20 min時提取物釋放率達69.64%，此時釋放率排序依次為：麥芽糊精＞混合＞變性淀粉，證明糊精較淀粉更易在微堿性環境中分解。這與羅鵬等[41]的結果相似，其利用β環糊精制備的葵花籽ACE抑制肽微膠囊，經過200 min的胃腸道消化后釋放率為74.2%。綜上所述，通過包埋可以使中藥提取物微膠囊在人體內達到緩釋效果。由圖5C可知儲存時間對不同壁材微膠囊ACE抑制率的影響。未經包埋的提取物，其中的酚類活性受噴霧干燥的影響，在一開始就低至39.18%，而通過麥芽糊精、變性淀粉、混合壁材包埋的其一開始的ACE抑制率分別為45.56%、43.42%、49.64%（P＜0.05），其中混合壁材包埋的微膠囊初始ACE抑制率最高。羅麗娟[24]以玉米淀粉、明膠為壁材，利用噴霧干燥對鯽魚ACE抑制肽進行包埋，也得到了相同結論：包埋后的微膠囊ACE抑制率顯著高于未包埋樣品。證明包埋對酚類等活性物質的保護作用是明顯的。隨著在空氣中暴露時間的延長，ACE抑制率均呈現出先快后慢的下降趨勢，最后逐漸穩定。室溫暴露7 d后，混合壁材包埋的ACE抑制率仍有22.36%，顯著高于單一麥芽糊精和變性淀粉包埋（P＜0.05），證明其對酚類活性的保護效果最為顯著。這與羅鵬[41]的結論相似，其制備的葵花籽ACE抑制肽微膠囊室溫儲存8 d后抑制率仍可達到29.2%。

圖5 微膠囊的釋放率與ACE抑制率Fig.5 Release rate and ACE inhibition rate of microcapsules

3 結論

麥芽糊精和變性淀粉1:1（w/w）作為壁材對枸杞、生姜、梔子提取物包埋效果最佳，包埋率為75.24%（P＜0.05）。其制備的微膠囊呈球型，表面最為連續完整，基本無孔洞或裂縫。紅外圖譜中酚類吸收峰強度減弱，證明提取物被包埋成功并形成了淀粉/糊精-酚類-明膠聚合體。通過混合壁材微膠囊化的枸杞、生姜、梔子提取物，苦味顯著降低，吸濕性較未包埋的降低了36.79%。同時混合壁材制備的微膠囊熱穩定性最高，該微膠囊經胃腸消化后釋放率為69.64%，ACE抑制率為49.64%（P＜0.05）與單一壁材包埋的微膠囊相比其消化釋放率接近，但ACE抑制率降低程度最少，為藥食同源提取物的微膠囊產品的應用提供一定理論基礎。