葡萄糖酸內酯酸化處理對未漂洗鱘魚糜凝膠特性的影響

向晨曦，徐新星，劉 康，李鈺金，高瑞昌，白 帆，汪金林, ，趙元暉,

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003；2.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江 212013；3.衢州鱘龍水產食品科技開發有限公司，浙江衢州 324004）

鱘魚是一種體型較大的淡水魚類，具有較高的經濟價值和科研價值[1]。鱘魚肉富含蛋白質和多不飽和脂肪酸，其中8種人體必需氨基酸配比均衡，營養非常豐富[2]。此外，鱘魚肉厚骨軟[3]，非常適合用來制作魚糜。魚糜是以海水魚或淡水魚為原料經過一系列加工制成的一種高蛋白、低脂肪、低膽固醇的水產食品，由于其營養健康、風味獨特深受消費者青睞[4]。在傳統魚糜制作過程中，漂洗是其中最重要的步驟之一，它可以去除魚肉中的水溶性蛋白質、色素、氣味、脂肪以及無機離子等成分，從而提高魚糜的凝膠強度和白度[5]。但同時漂洗出的蛋白和脂肪會造成營養物質大量流失及產率降低，漂洗后的廢水也會引起環境污染，且操作復雜，費時費力[6]。因此，有必要開發未漂洗魚糜產品解決上述問題。

葡萄糖酸內酯（GDL）是一種蛋白凝固劑，可水解釋放葡萄糖酸，使體系pH降低，從而減弱蛋白分子間的靜電斥力，在低溫下誘導蛋白質聚集形成凝膠[7]。GDL添加量為2.4%可獲得品質較高的羅非魚碎肉蛋白凝膠[8]。有研究發現在低溫條件下GDL可誘導肌肉蛋白形成凝膠網絡結構[9]。但目前關于GDL對未漂洗鱘魚糜凝膠特性影響鮮有報道。

本研究中以未漂洗鱘魚糜為原料，探究在低溫交聯過程中不同GDL添加量對魚糜凝膠化學作用力及膠凝特性的影響，以期為提高未漂洗淡水魚糜品質和開發新型魚糜制品提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鱘魚（施氏鱘和西伯利亞鱘雜交幼年鱘，體質量（1.5～2 kg） 購買于青島市城陽區水產養殖公司；食鹽 食品級，青島金貝歐公司；山梨糖醇、三聚磷酸鈉、葡萄糖酸內酯 食品級，河南萬邦實業有限公司；氯化鈉、尿素、硫酸銅、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、碳酸鈉、十二烷基硫酸鈉（SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、2-硝基苯甲酸（DTNB）、考馬斯亮藍R-250 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；Tris 分析純，美國Sigma公司。

TJ12-H絞肉機 廣東恒聯食品機械有限公司；FMB40雪花制冰機 上海冠森生物科技有限公司；NR60CP手持式色差儀 深圳市三恩馳科技有限公司；TMS-PRO質構儀 美國Food Technology公司；FJ-200高速均質機 上海標本模型廠；VL-5B高速離心機 湖南邁克爾實驗儀器有限公司；LG10-3A冷凍離心機 北京醫用離心機廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 未漂洗魚糜的制備 將新鮮的鱘魚用力擊暈，然后去掉魚頭、魚內臟和魚皮，取下魚肉切成小塊，用冰水將小塊魚肉沖洗干凈并放在碎冰上保持低溫，再將魚肉置于絞肉機（孔板直徑為3 mm）中絞2～3遍。然后絞碎的魚糜不經過漂洗、脫水等步驟，直接添加傳統抗凍劑（0.25%三聚磷酸鈉和4%山梨醇）并混合均勻，即為未漂洗鱘魚糜（水分含量為76.67%±0.19%）。最后將魚糜分裝進自封袋中（每袋300 g），放在-20 ℃下冷凍待用。

1.2.2 未漂洗魚糜凝膠的制備 將冷凍魚糜從冰箱取出并在4 ℃下解凍，空擂2 min，然后加入1.5%食鹽（以冷凍魚糜重量計，下同）、不同添加量（0%、1%、2%、3%和4%）的GDL及冰水繼續擂潰2 min，魚糜中水分含量在80%左右。最后在4 ℃下放置24 h形成凝膠。

1.2.3 指標測定方法

1.2.3.1 pH的測定 取5.0 g樣品，加入50 mL去離子水，均質30 s后靜置30 min，取上清液，使用pH計測定pH。

1.2.3.2 凝膠強度的測定 根據ZHANG等[10]的方法略作修改。使用質構分析儀進行測定，參數設置如下：探頭選用直徑為5 mm的圓柱形探頭，起始力為0.05 N，測試速度為1 mm/s，穿刺距離為10 mm。測定魚糜的凝膠強度。每個樣品測定8個平行。

1.2.3.3 質構的測定 參照常莉莉等[11]的方法略作修改。使用質構分析儀進行物性分析，參數設置如下：探頭選用直徑為35 mm的圓盤，起始力為0.05 N，測試速度為1 mm/s，形變量為40%，測定魚糜的硬度、彈性、咀嚼性、內聚性、膠黏性和粘附性。每個樣品測定8個平行。

1.2.3.4 持水性的測定 按照CAO等[12]的方法并稍作修改，稱取約1 g樣品（m1）用雙層濾紙包裹，置于離心管中。將離心管放入4 ℃的離心機中以5000 r/min離心10 min，離心后取出樣品稱量（m2）。每個樣品測定8個平行，按下列公式計算持水性：

1.2.3.5 白度的測定 將樣品放置在室溫下平衡30 min，采用手持色差儀進行測定其L*（亮度）、a*（紅度）和b*（黃度），每個樣品測定8次，按照如下公式計算白度[13]：

1.2.3.6 化學作用力的測定 參照NI等[14]的方法并略作修改。取2 g魚糜樣品分別溶于10 mL SA（0.05 mol/L NaCl）、SB（0.6 mol/L NaCl）、SC（0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素）和SD（0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素）4種溶液中，均質1 min，4 ℃下靜置1 h，以10000 r/min的轉速在4 ℃冷凍離心機中離心15 min，上清液中蛋白質含量采用雙縮脲法測定。按照下列公式計算：

1.2.3.7 總巰基的測定 參考BENJAKUL等[15]的方法。取稀釋至2 mg/mL的蛋白樣品1 mL，加入0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液（含8 mol/L尿素，2% SDS，10 mmol/L EDTA，pH6.8）9 mL，混勻后取4 mL混合液加入0.4 mL的0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液（含0.1% DTNB，pH8.0），在40 ℃水浴反應25 min，于412 nm處測吸光度。使用蒸餾水作為空白對照。按如下公式計算總巰基含量：

式中：A為412 nm處的吸光度；V為稀釋倍數；ε為吸光系數，13600 mol·cm/L；c為蛋白質濃度，mg/mL。

1.2.3.8 SDS-PAGE凝膠電泳 樣品經前處理后，將樣品加載到電泳儀上，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，在80 V電壓下運行30 min，然后在120 V電壓下運行3 h左右。電泳結束后用0.1%考馬斯亮藍R-250對凝膠振蕩染色2 h，用醋酸-乙醇溶液脫色過夜[16]。

1.3 統計分析

使用IBM SPSS Statistics 24計算平均值和標準差，用Duncan多重檢驗進行數據的顯著性分析（P＜0.05)，并采用Origin 2017進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同GDL添加量對未漂洗鱘魚糜凝膠pH的影響

魚糜凝膠pH隨GDL添加量變化的情況如圖1所示，不同濃度的GDL對魚糜凝膠的pH影響程度不同。魚糜不添加GDL時pH為6.54，由圖可知，當GDL添加量逐漸增加，pH呈顯著降低的趨勢（P＜0.05），分別為5.48、4.76、4.35和4.02。這是由于GDL是一種弱酸酸化劑，易溶于水，可以水解產生葡萄糖酸，從而使得魚糜凝膠的pH迅速下降。

圖1 不同GDL添加量下魚糜凝膠pH的變化Fig.1 Changes in pH of surimi gel under different GDL addition amounts

2.2 不同GDL添加量對未漂洗鱘魚糜凝膠強度的影響

凝膠強度可反映蛋白質凝膠內部結構的牢固程度[17]。如圖2所示，當GDL添加量從0%逐漸增加到3%時，魚糜凝膠強度呈增大趨勢，且在添加量為3%時最大。但是隨著添加量進一步增加，其凝膠強度顯著降低（P＜0.05）。pH會影響蛋白質分子的電荷性質來影響蛋白質分子的聚集[18]，因此凝膠強度出現這種先升后降的現象其原因可能是GDL分解產酸，較低的pH誘導蛋白質變形聚集形成強度較大的凝膠[19]，但是GDL過量添加會導致pH持續降低，蛋白質分子表面電荷排斥作用加強，影響了蛋白聚集體的形成從而導致凝膠強度降低[20]。這與鄭嚴等[21]使用不同GDL添加量處理真鯛魚糜時得到的結果類似。ZHANG等[22]研究發現GDL通過調節pH改變了電荷和豬血漿蛋白（PPP）溶液的聚集狀態，并得出0.3%GDL和0.2%轉谷氨酰胺酶共存時可誘導形成硬度良好的PPP冷固性凝膠的結論。由此可推斷適當的酸化可以形成凝膠性能優異的魚糜凝膠。

圖2 不同GDL添加量下魚糜凝膠強度的變化Fig.2 Changes in gel strength of surimi under different GDL addition amounts

2.3 不同GDL添加量對未漂洗鱘魚糜凝膠質構的影響

如表1所示，隨著GDL的增加，魚糜凝膠的硬度和彈性增大，較高添加量的GDL會誘導形成高強度的魚糜凝膠。硬度和彈性是反映魚糜口感的重要參數，主要與參與形成凝膠網絡結構的力有關。硬度在添加量為3%時最大，為19.84±2.26 N，之后進一步增加添加量對魚糜的硬度沒有產生明顯的影響。從彈性指標來看，隨著添加量的增加，彈性呈現上下往復變化，與對照組相比，總體有所提高。這表明較高的GDL添加量可通過迅速降低pH來增加蛋白分子間的結合力。當添加量從1%逐漸添加到4%時，內聚性、咀嚼性和膠黏性均呈現先持續增大后保持穩定的趨勢。黏附性隨著GDL的增加而顯著降低（P＜0.05），這是由于不添加GDL時為擂潰后的魚肉糊，探頭壓縮完與之分離時因為黏性高受到較大的牽引力，而添加GDL后魚糜凝膠的黏性下降，黏附性隨之降低。

表1 不同GDL添加量下魚糜凝膠質構的變化Table 1 Changes in texture of surimi gel under different GDL addition amounts

2.4 不同GDL添加量對未漂洗鱘魚糜凝膠持水性的影響

持水性表示凝膠網絡結構保持水分的能力，同時也能夠在一定程度上反映出魚糜的凝膠狀況[23]。圖3 反映了GDL添加量對未漂洗鱘魚糜凝膠持水性的影響，與對照組相比，隨著GDL添加量的增加，魚糜凝膠的持水性基本呈先升高后下降的趨勢。當添加量為2%和3%時持水性最好，分別為87.26%±0.96%和86.82%±0.97%，二者之間無顯著性差異（P＞0.05）。添加GDL后，酸誘導魚糜凝膠網絡結構形成，因此與對照組相比顯著提高了魚糜凝膠強度和持水性（P＜0.05），而另一方面可能是由于當添加量逐漸增加，蛋白分子內部的疏水基團逐漸暴露，疏水相互作用增大導致鎖水能力下降[24]，這兩方面綜合影響了持水性的變化。高宇等[25]研究也發現GDL的添加有利于提高羅非魚碎肉蛋白凝膠的持水性。

圖3 不同GDL添加量下魚糜凝膠持水性的變化Fig.3 Changes in water holding capacity of surimi gel under different GDL addition amounts

2.5 不同GDL添加量對未漂洗鱘魚糜凝膠白度的影響

一般來說，魚糜凝膠的色澤會根據凝膠情況而表現出不同，白度越高表明魚糜制品品質越高，越容易受到消費者的喜愛。由表2可知，添加GDL后的魚糜凝膠白度顯著高于對照組（P＜0.05），且白度值隨著GDL添加量的增大而逐漸增大，但添加量超過3%時白度值變化不明顯。白度增加是蛋白變性的結果[21]，與對照組相比較，GDL的添加明顯提高了魚糜凝膠的亮度值（L*）和白度值，由此可以推斷出GDL影響了魚糜蛋白的結構變化，增大了變性程度。此外，凝膠的白度值也會受到蛋白質組成以及魚糜表面光學特性的影響[26]。

表2 不同GDL添加量下魚糜凝膠白度的變化Table 2 Changes in whiteness of surimi gel under different GDL addition amounts

2.6 不同GDL添加量對未漂洗鱘魚糜凝膠化學作用力的影響

氫鍵、離子鍵和疏水相互作用等在魚糜凝膠網絡結構的形成中發揮的重要作用[27]。從圖4中可以

看出，不添加GDL時魚糜蛋白分子間作用力主要包括離子鍵和氫鍵，疏水相互作用所占比例很小。隨著GDL含量的增加，氫鍵和離子鍵由于被破壞而逐漸降低，說明氫鍵和離子鍵不是維持GDL誘導魚糜凝膠結構的主要化學作用力，而與對照組相比，疏水相互作用顯著增強（P＜0.05），這表明在GDL低溫誘導魚糜凝膠化的過程中形成了更多的疏水相互作用，因此疏水相互作用是維持魚糜凝膠網絡結構穩定的主要化學作用力。高宇等[25]認為GDL酸處理使得蛋白變性，結構展開，疏水基團暴露從而形成疏水相互作用。而GDL添加量過高時，疏水相互作用減小，這與王琳[28]的研究結果相似，推測可能與蛋白質構下降有關。

2.7 不同GDL添加量對未漂洗鱘魚糜凝膠總巰基含量的影響

巰基是蛋白中反應活性最強的功能集基團，總巰基含量變化可間接反映二硫鍵變化，二硫鍵是維系凝膠體系的重要作用力[29]。由圖5可知，整體上來看總巰基含量隨GDL的增加呈先下降后升高的趨勢，總巰基的減少是由于二硫鍵的形成，GDL降低了魚糜凝膠的pH，導致蛋白質變性引起結構變化，暴露出的游離巰基被氧化形成了二硫鍵[7]，說明在酸誘導魚糜凝膠網絡結構形成的過程中也有少量二硫鍵的參與。但從圖中可知，當GDL含量進一步增加至3%以上時總巰基含量升高，因此pH過低不利于二硫鍵的形成，在許艷順[20]的研究中也發現了類似的結論。

圖5 不同GDL添加量下魚糜凝膠總巰基含量的變化Fig.5 Changes in total sulfhydryl content of surimi gel under different GDL addition amounts

2.8 SDS-PAGE凝膠電泳分析

不同GDL添加量的未漂洗鱘魚糜凝膠的蛋白質電泳結果如圖6所示。肌球蛋白重鏈（MHC，220 kDa）、肌動蛋白（AC，43 kDa）是魚糜凝膠中的主要蛋白質，其中肌球蛋白是魚糜凝膠網絡結構形成的關鍵蛋白[30]。從圖6中可以看出，與對照組相比，添加GDL后魚糜凝膠MHC條帶的強度呈現出一定程度的減弱，表明了肌球蛋白發生了變化，在酸化誘導魚糜凝膠的過程中MHC通過催化交聯形成了更多的ε-（γ-谷氨酰）賴氨酸鍵，從而提高了魚糜凝膠的質構特性[31]。AC條帶的強度隨著GDL添加量的增加逐漸減弱，但繼續增加GDL添加量AC條帶沒有明顯變化。楊明柳等[32]研究發現向鱖魚魚糜中添加谷氨酰胺轉胺酶后MHC和AC條帶減弱，促進了蛋白交聯。

圖6 不同GDL添加量下魚糜凝膠蛋白變化的電泳圖Fig.6 Electrophoresis patterns of surimi gel protein under different GDL addition amounts

3 結論

不同GDL添加量對未漂洗鱘魚糜凝膠特性的影響實驗結果表明，與對照組相比，添加GDL后可以顯著提高未漂鱘魚糜凝膠的凝膠強度、硬度、咀嚼性、膠黏性、白度和持水性（P＜0.05），并且在添加量為3%時達到最大。過量GDL會導致蛋白質聚集受到影響從而減弱魚糜凝膠特性。在GDL酸化誘導魚糜凝膠過程中，疏水相互作用是維持魚糜凝膠網絡結構穩定的主要作用力。總巰基含量和SDSPAGE凝膠電泳結果表明二硫鍵的增加和蛋白質共價交聯程度的提高促進了魚糜凝膠網絡結構的形成。綜上，GDL添加量為3%時可獲得品質較好的魚糜凝膠。這項研究為開發低溫凝膠化魚糜制品提供了重要理論支撐。