瑞士乳桿菌H11發酵乳飲料的ACE抑制活性及代謝組學研究

王昊乾，李伯海，趙景娜，劉文俊，陳永福，孫天松

（內蒙古農業大學，乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，農業農村部奶制品加工重點實驗室，內蒙古自治區乳品生物技術與工程重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010018）

活性乳飲料是指將原料乳經過益生菌發酵后得到的具有獨特風味特點和有利于人體健康的乳制品[1]。能夠用于活性乳飲料中的微生物需具有良好的益生功效，且能夠耐受胃腸液并定殖于人體腸道保持活性，進而促進人體健康[2-3]。瑞士乳桿菌屬于革蘭氏陽性異型發酵乳酸菌，具有較強的蛋白水解系統，能夠通過水解牛乳中的蛋白質產生多種代謝產物，如有機酸和多肽[4]，這些代謝物有助于發酵乳制品質地和風味的形成[5]。在發酵過程中，瑞士乳桿菌通過蛋白酶水解產生大量的生物活性肽，賦予了發酵乳制品優良的益生特性[6-7]。研究表明，具有生物活性功能的發酵乳制品具有提高免疫力、加強老年人認知功能、抗突變、降血壓和抗氧化等健康功效[8-9]。

高血壓是威脅人體健康的慢性疾病之一，人體自身可通過多種途徑來調節血壓，血管緊張素轉化酶（ACE）對維持血壓平衡起關鍵作用[10]，但藥物治療高血壓會帶來一系列的不良反應，而酶促水解和微生物發酵牛奶蛋白所釋放出的降血壓肽不會對人體產生副作用[11]。過去的十幾年中，食品衍生肽為預防和治療高血壓方面提供了理論依據[12-13]。

目前市面上常見的發酵乳飲料，如日本的養樂多、伊利每益添和蒙牛優益C等發酵乳飲料基本選擇干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌作為發酵劑，例如蒙牛優益C選擇使用副干酪乳桿菌Lc-01作為發酵劑[1,14]，而使用瑞士乳桿菌在功能性飲料的開發和應用方面的研究較少[14]。因此，本文以商業發酵劑副干酪乳桿菌Lc-01作為對照組，以前期篩選的一株具有良好發酵及益生特性的瑞士乳桿菌H11為研究對象，旨在研究瑞士乳桿菌H11在活性乳飲料貯藏期間的ACE抑制活性、揮發性風味物質和代謝物與副干酪乳桿菌Lc-01之間的差異，為開發新型安全高效的益生菌乳飲料提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瑞士乳桿菌H11 內蒙古農業大學乳酸菌菌種資源庫提供，副干酪乳桿菌Lc-01 購自丹麥科漢森公司；血管緊張素轉換酶（ACE，0.25 U/g）、馬尿酸（HA）、馬尿酰組胺酰亮氨酸（HHL） Sigma公司；三氟乙酸分析級、乙腈色譜級、甲醇色譜級 Fisher Chemicals公司；脫脂乳粉 新西蘭恒天然公司。

7697A-GC-7890B-MS-5977C氣相色譜-質譜聯用儀、Agilent1100液相色譜系統 Agilent公司；UPLC-Q TOF-MS超高效液相-四級桿-飛行時間質譜儀 Waters公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵乳飲料的制備 將13%的脫脂奶粉和2%的葡萄糖溶解于45 ℃蒸餾水中，攪拌均勻，靜置30 min[15]。在115 ℃下加熱10 min后取出，分裝至250 mL無菌瓶中，待其褐變后冷卻至37 ℃，分別接種5×106CFU/mL瑞士乳桿菌H11和副干酪乳桿菌Lc-01，在37 ℃下發酵。當滴定酸度（Titer acidity，TA）達到200oT時停止發酵。最后將發酵乳與無菌蔗糖溶液按體積比25:75進行混合，冷藏28 d，在貯藏0、7、14、21、28 d時分別取樣，用于分析測定。

1.2.2 體外ACE抑制活性的測定 樣品前處理：將樣品于4500×g，離心10 min，取上清液，用NaOH調節pH至8.3。取發酵乳飲料上清液和HHL溶液各100 μL混合，于37 ℃下培養2 min，再加入100 μL的ACE，將混合物在37 ℃下孵育40 min。在85 ℃水浴中加熱10 min；將反應液注入400 μL的0.1 mol/L EDTA溶液中，使用0.22 μm的濾膜過濾待測。

使用RP-HPLC法測定酶解反應產物中馬尿酸的含量。色譜柱為ZORBAX C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，Agilent，USA），流動相：體積比為22%乙腈（含0.1%三氟乙酸）和78%去離子水（含0.1%三氟乙酸）溶液；流速為1.0 mL/min；檢測波長為228 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

式中，[HA]c：空白對照組中馬尿酸濃度；[HA]s：含有ACE抑制劑的待測樣品中馬尿酸濃度；[HA]h：HHL標品中馬尿酸濃度。

1.2.3 ACE抑制肽（Val-Pro-Pro（VPP）和Ile-Pro-Pro（IPP））含量測定 樣品前處理：將樣品于4500×g，離心10 min，取100 μL樣品與400 μL的乙腈混合，于12000×g離心10 min，樣品于0.22 μm濾膜過濾后，上機檢測。

色譜條件：色譜柱T3 column（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫為45 ℃；流速為0.4 mL/min；進樣量為4 μL；流動相A為含0.1%甲酸的去離子水；流動相B為含0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脫程序（B%）：

0～1 min，3%B；1～5 min，3%～30%B；5～5.1 min，30%～90%B；5.1～7.1 min，90%B；7.1～7.2 min，90%～3%B；7.2～9.2 min，3%B。

1.2.4 風味物質的測定 萃取頭老化條件：進樣口溫度250 ℃，老化20 min。

固相微萃取條件：將老化好的萃取頭插入樣品瓶中，50 ℃，300 r/min下吸附60 min，隨后在進樣口處250 ℃解吸附3 min。

氣相色譜條件：升溫程序：起始溫度為35 ℃，保持5 min；以5 ℃/min升溫至140 ℃，保持2 min；以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持3 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為氦氣（≥99.999%），流速1.0 mL/min；不分流進樣。

質譜條件：電離方式為EI源，電子能量70 eV；發射電流100 μA；離子源溫度為230 ℃；質量掃描范圍（m/z）33～450。利用GC/MS工作站軟件Masshunter自帶NIST 11標準庫自動檢索各組分質譜數據，結合質譜裂解規律確定化學成分，利用面積歸一化法計算出各組分相對峰面積百分比。

1.2.5 代謝差異物分析 色譜條件：使用BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm,1.7 μm），柱溫40 ℃、流速0.3 mL/min，進樣量10 μL。最佳流動相由（A）0.1%甲酸水溶液和（B）0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫程序：0～6 min，5%～40%B；6～18 min，40%～85%B；18～18.5 min，85%～90%B；18.5～22 min，90%～90%B；22～22.5 min，90%～5%B；22.5～25 min，5%B。

質譜條件：采用ESI正離子（ESI+）模式進行掃描，離子源溫度為100 ℃，脫溶劑氣溫度為350 ℃，脫溶氣流量為800 L/h，錐氣流量為50 L/h，毛細管電壓為3 kV，采樣錐電壓為40 V，碰撞能量為6 eV，萃取錐電壓為3 V，荷質比掃描范圍50～1200 m/z。采用濃度為為200 ng/mL的亮氨酸-腦啡肽（556.2771 u）作為校正液，流速為30 μL/min。

1.3 數據處理及統計學分析

用SPSS 22.0進行Pearson相關性和方差分析；用Origin 8.5用于繪制圖表；將UPLC/Q-TOF MS測定的原始數據經MassLynx 4.1進行數據處理，通過SIMCA 14.0和MetaboAnalyst v.5.0進行主成分分析、T檢驗分析和選擇差異變量（P＜0.05），與METLIIN、HMDB、KEGG、MASSBANK等生化數據庫中的信息進行比較，對代謝差異進行分析。

2 結果與討論

2.1 ACE抑制率的變化分析

已有研究表明，乳桿菌屬的發酵乳中具有較高的ACE抑制活性，瑞士乳桿菌具有較強的蛋白水解系統，通過水解牛乳蛋白能夠產生具有ACE抑制活性的肽，進一步水解產生氨基酸，滿足了發酵乳制品的營養需求[16]。從圖1可以看出，瑞士乳桿菌H11和副干酪乳桿菌Lc-01的發酵乳飲料在貯藏期間均顯示出對ACE的抑制活性，這是由于益生菌的胞外蛋白酶將牛奶蛋白水解為寡肽，然后被胞內肽酶進一步水解為小肽和氨基酸[17]。而存在于肽的C端末位的疏水性氨基酸（例如Try、Phe、Trp、Ala、Ile、Val和Met）或帶正電荷的氨基酸（例如Arg和Lys以及Pro）均具有較高的ACE抑制活性[18]，例如，在C末端存在苯丙氨酸殘基可能會增加肽的ACE抑制活性[10]。瑞士乳桿菌H11和副干酪乳桿菌Lc-01發酵乳飲料中的ACE抑制活性在貯藏過程中呈上升趨勢，且瑞士乳桿菌H11比副干酪乳桿菌Lc-01顯示出更高的ACE抑制活性，尤其是在貯藏21 d時瑞士乳桿菌H11表現出最高的ACE抑制活性（70.13%±2.83%），這可能是貯藏過程中pH和鈣離子濃度的變化導致了蛋白質二次水解[17,19]。

圖1 貯藏期間發酵乳飲料的ACE抑制率變化Fig.1 Change in ACE inhibition of fermented milk beverages during storage

2.2 VPP和IPP含量測定

瑞士乳桿菌通過水解牛乳中的蛋白質釋放大量的肽，例如抗高血壓肽VPP和IPP以及血管緊張素轉化酶（ACE）抑制肽，其中ACE是控制高血壓疾病的有效治療靶點。從圖2可知，在貯藏期間，瑞士乳桿菌H11的發酵乳飲料中的VPP和IPP含量顯著高于Lc-01（P＜0.05），且Lc-01的乳飲料在貯藏期間未檢測到IPP且只檢測到少量的VPP，這也是瑞士乳桿菌H11發酵乳飲料中ACE抑制活性高于Lc-01的原因。Chen等[6]證明了瑞士乳桿菌H9制備的發酵乳中具有86.4%±1.5%的體外ACE抑制活性，并且具有較高的VPP（2.409±0.229 μmol/L）和IPP（1.612±0.114 μmol/L）濃度。研究發現除了VPP和IPP外，通過水解蛋白質所產生的生物活性肽，例如αs1-CNf（90～94）（RYLGY）、αs1-CNf（143～149）（AYFYPEL）和αs2-CNf（89～95）（YQKFPQY）等多種活性肽也具有降血壓的功能[20-21]。

圖2 貯藏期間發酵乳飲料中VPP和IPP含量的變化Fig.2 Changes in VPP and IPP content of fermented milk beverages during storage

2.3 基于SPME-GC-MS技術的風味物質分析

發酵乳飲料中具有多種揮發性風味化合物，其決定了發酵乳飲料的獨特風味，采用SPME-GCMS技術對2組發酵乳飲料進行風味物質的測定，瑞士乳桿菌H11的發酵乳酸菌飲料中共檢測54種揮發性風味物質，其中酮類物質6種，醇類物質13種，醛類物質7種，酸類物質10種，酯類物質8種，其他物質10種，對照樣品中共檢測73種揮發性風味物質，其中酮類物質13種，醇類物質16種，醛類物質6種，酸類物質12種，酯類物質6種，其他物質20種。為了研究2組樣品之間的揮發性風味物質的差異以及貯藏時間對揮發性風味物質的影響，選擇在貯藏過程中均含有且相對含量較高的7種風味物質，包括2-庚酮、2-壬醇、2-壬酮、2-十一烷酮、乙酸、2-十一烷醇和十一醛，各物質相對含量見表1。

由表1可以看出，瑞士乳桿菌H11和對照菌株Lc-01樣品中的2-庚酮、2-壬酮相對含量均較高，在4 ℃貯藏28 d后分別為43.84%、12.39%和26.29%、15.80%。酮類物質產生是由于氨基酸的熱降解、游離脂肪酸氧化和美拉德反應形成的，研究表明2-庚酮能夠賦予發酵乳水果味[22]，2-壬酮能賦予發酵乳果香、清香及奶油氣息[23]。瑞士乳桿菌H11發酵乳飲料中的醇類和醛類物質含量在貯藏期間顯著低于副干酪乳桿菌Lc-01（P＜0.05），醛源自乳脂中不飽和脂肪酸的自動氧化，因為它們具有相對活躍的化學特性，很容易被還原成酸性化合物或醇類[24]。酸是甲基酮、醇、內酯和酯類物質的前體，對乳制品中的氣味產生非常重要[25]，在貯藏期間，瑞士乳桿菌H11發酵乳飲料中的己酸含量較高，其為乳制品提供類似于醋的強烈風味[26]。劉曉嬌等[27]采用GC-MS技術對活性乳酸菌飲料的香氣產物分析表明，主要的風味物質包括丁酸乙酯、己醛、2-庚酮、3-丁烯-1-醇、乙酸、2-壬酮等，其中2-庚酮和2-壬酮相對含量最高，分別為37.68%和17.86%，乙酸含量為4.97%，與本試驗結果相近。上述結果可得知，L.helveticusH11能夠賦予發酵乳飲料香氣，具有較高的應用價值。

表1 貯藏期間發酵乳飲料中的風味物質的變化Table 1 Changes in flavour substances of fermented milk beverages during storage

2.4 基于代謝組學的代謝物差異分析

使用代謝組學分析貯藏過程中代謝產物的變化，從而預測產品的營養價值[28]。通過UPLC/QTOF MS/MS監測了瑞士乳桿菌H11和副干酪乳桿菌Lc-01兩種發酵乳飲料在不同時間點的代謝譜變化，尋找兩種發酵乳飲料之間的差異代謝物，在瑞士乳桿菌H11和Lc-01中分別檢測到333和309種代謝物。為了可視化兩組在不同時間點的代謝動力學，進行了PCA分析（圖3）。兩種發酵乳飲料分別形成兩個區域，隨著貯藏時間的延長，代謝譜發生了變化，于14 d后保持穩定。這表明在貯藏期間，瑞士乳桿菌H11和副干酪乳桿菌Lc-01仍具有代謝活性，使發酵乳飲料中的蛋白質發生二次水解，產生了更多的生物活性物質。

圖3 貯藏期間兩種發酵乳飲料代謝差異物的變化Fig.3 Changes in metabolic differentials of two fermented milk beverages during storage

瑞士乳桿菌通過細胞膜蛋白（CEP）將牛奶中的蛋白質分解為寡肽，再通過細胞內肽酶進一步水解成游離氨基酸，形成揮發性和非揮發性化合物，從而賦予發酵乳飲料特殊的風味[29]。當VIP值＞1.5，Fold Change（差異倍數）＞2和P＜0.01時，在瑞士乳桿菌H11和對照發酵乳飲料中鑒定出16種代謝差異物，包括12種下調的代謝產物和4種上調的代謝產物（表2），主要為氨基酸、肽和有機酸；研究發現，通過LC-MS和GC-MS兩種代謝組學技術對發酵乳制品進行研究，發現主要的代謝產物以氨基酸、短肽、脂類和有機酸為主[29]。通過對比KEGG數據庫，發現瑞士乳桿菌H11和副干酪乳桿菌Lc-01之間的代謝差異物主要涉及氨基酸代謝、三羧酸循環以及磷酸戊糖途徑，由于牛乳中的必需氨基酸成分較少，瑞士乳桿菌缺乏16種氨基酸合成基因，是高度營養缺陷型菌株，通過自身復雜的蛋白酶水解系統水解牛乳蛋白產生相應的氨基酸來維持生長發育，這可能是瑞士乳桿菌H11發酵乳飲料中四種游離氨基酸（4-氨基丁醛、L-脯氨酸、L-蘇氨酸和L-苯丙氨酸）濃度在發酵和儲存期間高于副干酪乳桿菌Lc-01的原因[21,30]；另外，有研究發現由于瑞士乳桿菌自身復雜的水解系統，在發酵過程中能夠有助于改善發酵產品的風味和質地，同時產生的生物活性肽有益于人體健康[31-32]。

表2 瑞士乳桿菌H11和副干酪乳桿菌Lc-01發酵乳飲料在貯藏期間共有代謝產物變化Table 2 Changes in shared metabolites of L. helveticus H11 and L. paracasei Lc-01 fermented milk beverages during storage

3 結論

本文通過液相色譜、SPME-GC-MS和UPLCQ-TOF MS等代謝組學技術對瑞士乳桿菌H11和副干酪乳桿菌Lc-01發酵乳飲料的ACE抑制活性、代謝差異物和揮發性風味物質進行分析。結果表明，瑞士乳桿菌H11的ACE抑制活性比副干酪乳桿菌Lc-01高60%以上，ACE抑制肽VPP和IPP含量也顯著高于Lc-01（P＜0.05）。瑞士乳桿菌H11和副干酪乳桿菌Lc-01的主要代謝差異物為氨基酸、肽和有機酸，瑞士乳桿菌H11制備的活性乳飲料酸味更強且有奶油香氣。綜上所述，瑞士乳桿菌H11在降血壓功能性發酵乳飲料的開發具有廣闊的發展前景。