歐拉型藏羊源糞腸球菌的分離鑒定及藥敏實驗

陳曉慧，徐淑琴，馬祥兆，賀 曦，賀曉龍，冶貴生

（青海大學農牧學院，青海西寧 810016）

歐拉型藏羊是高寒牧區優勢畜種之一，具有較強的抗寒性與抗病能力。然而隨著飼養規模擴大，藏羊消化道類疫病多發且缺乏良好的治療方法，盡管抗生素能治療消化道類疾病，但會打破腸道菌群平衡狀態，長期使用抗生素會導致畜產品的藥物殘留和耐藥菌株的產生，且引起腸道菌群紊亂。因此開發以益生菌為原材料的微生態制劑對藏羊腸道進行調控成為主流。益生菌是一種天然存在的微生物，它通過改變宿主共生微生物菌群、調節免疫、增強腸道屏障功能來賦予健康益處[1]。益生菌的使用被廣泛認為是穩定或改善腸道系統的一種有前途的方法，在宿主內的定植特異性可直接影響微生態益生菌制劑的臨床應用效果，選擇菌種的最好方式是采用分離自同源動物腸道的優良菌種。長期以來腸球菌一直被用作益生菌和食品發酵，腸球菌是哺乳動物胃腸道內正常微生物群體中的重要組成部分[2]，特別是糞腸球菌（Enterococcus faecalis），研究表明優良的糞腸球菌菌株主要來源于動物機體內[3]。

糞腸球菌是一種革蘭陽性兼性厭氧菌，是廣泛存在于動物腸道內的益生菌群[4]。糞腸球菌通過快速定植并耐受胃腸道的復雜環境來發揮益生作用[5]。糞腸球菌在調節腸道菌群環境中發揮著重要作用[6]，可通過產生細菌素類抑菌物質，抑制大腸桿菌和沙門氏菌等病原菌的生長，改善腸道微環境，還能抑制腸道內產尿素酶細菌和腐敗菌的繁殖，減少腸道尿素酶和內毒素的含量，使血液中氨和內毒素的含量下降，從而提高家畜抗病性和生產性能等[7]。微生態制劑可有效地調節動物腸道菌群的結構組成以及維持腸道菌群穩態，是目前替代抗生素研究的突破點[8]。不同動物腸道中的菌群都有一定特異性，來源與使用對象相同時，益生菌可更好地發揮益生效果。目前關于藏羊源腸道益生菌的研究報道很少，本研究對健康歐拉型藏羊腸道細菌進行分離培養與鑒定，旨在為其歐拉型藏羊源微生態制劑的研發提供候選菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

健康歐拉型藏羊腸道內容物樣本 來源于青海省海東市民和縣某養殖場；大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、產氣莢膜梭菌 均來自于青海大學農牧學院動物醫學系高原動物疾病研究室；糞腸球菌固體培養基（MRS固體培養基）、糞腸球菌液體培養基（MRS液體培養基）、Pfizer腸球菌選擇性瓊脂、細菌生化鑒定管 青島海博生物技術有限公司；革蘭氏染色試劑盒 珠海貝索生物技術有限公司；藥敏紙片

杭州濱和生物有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司。

立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司；恒溫培養搖床

上海藍豹實驗儀器有限公司；生物安全柜 新加坡藝思高科技有限公司；DYY-12C型電泳儀電源北京市六一儀器廠；凝膠成像系統 萊普特科學儀器（北京）有限公司；紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株分離篩選 無菌操作采集歐拉型藏羊腸道內容物樣品1 mL置3 mL MRS液體培養基中，37 ℃恒溫厭氧培養16～24 h。將通過液體培養過的菌液接種在MRS的固體培養基上進行劃線，37 ℃恒溫培養箱倒置培養48 h，觀察菌落形態，選取不同形態，大小，顏色的單個菌落劃線于Pfizer腸球菌選擇性瓊脂培養基，厭氧培養48 h，純化三次或三次以上，直到培養基菌落單一、穩定為止。

1.2.2 形態學鑒定 將純化后所得疑似菌株，通過革蘭氏染色，于光學顯微鏡100×油鏡下觀察其形態特征。

1.2.3 生化鑒定 按照菌株生化鑒定標準試劑盒說明書對分離菌株EF1-mh進行生化試驗測定。

1.2.4 分子生物學鑒定 參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取分離菌株EF1-mh基因組DNA。以提取的分離菌株EF1-mh基因組DNA為模板，采用16S rDNA通用引物進行PCR擴增。引物序列為：

27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR擴增體系為（50 μL）：上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，Premix Taq 25 μL，ddH2O 22 μL。擴增條件為：95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環，72 ℃末端延伸10 min，4 ℃保存；同時設置陰性對照。將得到的PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若PCR擴增產物在1500 bp左右，將PCR擴增產物送至生物公司進行測序。

16S rDNA系統發育樹的構建及同源性分析：使用DNA star軟件中的Seq Man進行序列拼接、校對，利用BLAST網站和GeneBank數據庫中收錄的糞腸球菌參考序列，對測序結果進行同源性比對分析，并構建系統發育樹。

1.2.5 生長曲線測定和產酸能力試驗 取2%分離菌株EF1-mh菌懸液接種于5 mL MRS液體培養基內，37 ℃，150 r/min恒溫培養24 h，從0 h開始，每隔2 h取樣一次，使用紫外可見分光光度計測定波長600 nm處的吸光度值OD，并測定pH，每時間點取樣做三次重復，記錄數據，繪制曲線圖。

1.2.6 藥敏試驗 采用K-B紙片擴散法[9]，檢測分離菌株EF1-mh對30種抗生素的敏感性。將待測菌株均勻涂布于MRS固體培養基上，37 ℃培養18 h，挑取單個菌落于5 mL MRS液體培養基中37 ℃恒溫厭氧培養12～16 h，將糞腸球菌增殖液稀釋至0.5麥氏濁度，使用無菌棉簽涂布在MRS瓊脂平板上，待瓊脂表面水分稍干，將藥敏紙片平整地貼在平板上，37 ℃倒置培養18～24 h，以藥敏紙片為中心測定抑菌圈直徑，統計記錄抑菌結果：敏感（S）、中等敏感（I）、耐藥（R）三種形式記錄。

1.2.7 抑菌試驗 使用牛津杯法[10]測定分離菌株EF1-mh對大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門氏菌（Salmonella）和產氣莢膜梭菌（C.perfringens）的抑菌能力。以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和產氣莢膜梭菌為指示菌，將致病菌菌液濃度稀釋至1×108CFU/mL，分別取100 μL均勻涂布于營養瓊脂上，無菌操作放置牛津杯，利用牛津杯進行打孔，受試菌懸液12000 r/min離心10 min，收集上清液，取200 μL加至孔內，4 ℃預擴散12 h，37 ℃恒溫培養24 h，測量抑菌圈直徑。

1.3 數據處理

使用DNA star軟件中的Seq Man進行序列拼接、校對，利用BLAST網站和GeneBank數據庫進行同源比對分析；使用MEGA 7.0軟件構建系統進化樹；Excel 2019進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 糞腸球菌鑒定結果

2.1.1 形態學鑒定結果 經過MRS固體培養基分離培養，該菌株菌落呈乳白色，表面光滑，邊緣整齊（圖1A），經Pfizer腸球菌選擇性瓊脂分離培養篩選到陽性疑似菌，呈棕黑色菌落，周圍有棕色圈（圖1B）。通過革蘭氏染色鏡檢，油鏡（100×）下可見藍紫色球菌，初步判斷為革蘭陽性球菌，呈短鏈狀或成對排列，通常不運動，菌體沒有芽孢和菌毛，符合糞腸球菌的菌體形態特征[11]（圖1C）。

圖1 分離菌株EF1-mh 形態學結果Fig.1 Morphological results of strain EF1-mh

2.1.2 生化鑒定結果 對分離菌株EF1-mh進行生化鑒定，結果顯示，水楊苷、麥芽糖、L-精氨酸雙水解酶、葡萄糖、果糖、半乳糖、蕈糖、膽汁七葉苷、乳糖、纖維二糖、蔗糖、甲基紅、馬尿酸鹽指標均為陽性；甘露醇、山梨醇、棉子糖、木糖、硫化氫、L-鼠李糖、蛋白胨水、菊糖、阿拉伯糖、吲哚試驗、西蒙氏枸櫞酸鹽、松三糖、VP實驗、硝酸鹽、葡萄糖酸鹽指標均為陰性。

生化鑒定結果見表1，結果表明該分離菌能分解麥芽糖、葡萄糖、果糖等；可利用水楊苷；具有L-精氨酸雙水解酶活性；膽汁七葉苷瓊脂指示劑結果呈黑色；不能分解甘露醇、山梨醇、棉子糖、L-鼠李糖、阿拉伯糖等；不產生硫化氫；吲哚試驗、VP試驗呈陰性；不利用西蒙氏枸櫞酸鹽和葡萄糖酸鹽做為能源，不能還原硝酸鹽，參照《伯杰細菌鑒定手冊》[12]分離菌株EF1-mh符合糞腸球菌的生化特征，且與鐘浪等[13]篩選的牦牛源糞腸球菌生化特性研究結果相符。

表1 生化鑒定試驗結果Table 1 Biochemical identification results

2.1.3 分子生物學鑒定結果 使用16S rDNA通用引物對疑似糞腸球菌分離菌株EF1-mh DNA進行PCR擴增，經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增結果如圖2，目的條帶大小為1500 bp左右，符合預期設定。使用NCBI在線軟件對16S rDNA序列進行BLAST同源性比對，結果顯示分離菌株EF1-mh 16S測序長度為1461 bp，經過同源性比對分析得知分離菌株EF1-mh與GeneBank中11株糞腸球菌同源性在96.3%～97.2%之間，其中與糞腸球菌MH793511.1同源性最高，為97.2%，與糞腸球菌KC819130.1的同源性次之，為97.0%（如圖3）。分離菌株EF1-mh與參考菌株16S rDNA基因序列所繪制的系統發育樹（如圖4），且在系統發育樹上與糞腸球菌MT35 6183.1劃分為同一支，從分子水平確定該分離菌株EF1-mh為糞腸球菌。

圖2 分離菌株EF1-mh 16S rDNA基因PCR擴增Fig.2 PCR amplification of 16S rDNA gene in isolated strain EF1-mh

圖3 菌株同源性比對分析Fig.3 Sequence homology of strains

圖4 菌株的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strains

2.2 生長曲線測定和產酸能力試驗結果

生長曲線能夠體現細菌的數量變化、生長與代謝狀況，研究表明，腸球菌生長代謝速度快，繁殖力強。在本試驗中，如圖5所示，糞腸球菌EF1-mh在接種培養基后約6 h后進入對數生長期，并持續到14 h；16～18 h基本進入穩定期，生長速度降低即緩慢生長。任曉燕等[14]使用分光光度計和活菌計數2種方法對糞腸球菌生長曲線進行測定，兩種方法結果一致，即糞腸球菌對數增長期是6～14 h，穩定期是16～18 h，18 h后進入衰亡期。并且糞腸球菌EF1-mh生長能力與石春衛等[15]篩選的糞腸球菌在24 h內的生長能力趨勢一致，這表明篩選出的糞腸球菌可在營養充足的環境下快速生長，滿足優良益生菌的特性。

圖5 菌株生長曲線和和產酸能力Fig.5 Strain growth curves and acid production capacity of strains

糞腸球菌EF1-mh在MRS肉湯中培養6 h后pH下降，產酸能力弱，在18 h趨于穩定pH達到約在4.2左右，幾乎不產酸，表明分離菌株EF1-mh具有弱產酸能力，并且所測得EF1-mh菌株產酸能力結果與桑夢琪等[16]、劉金艷[17]測定的糞腸球菌產酸能力結果一致，pH從約6.0降至4.2左右。研究表明糞腸球菌作為動物腸道內乳酸類腸球菌的原生菌種，能分泌L型乳酸，還可把部分糖類的無氮浸出物轉化為乳酸供機體使用[18]。

2.3 藥敏試驗結果

糞腸球菌EF1-mh對苯唑西林、頭孢呋辛、頭孢氨芐、頭孢拉定、多西環素、米諾環素表現出中度敏感；對青霉素、氨芐西林、羧芐西林、哌拉西林、頭孢曲松、頭孢唑啉、頭孢哌酮、四環素、新霉素、慶大霉素、丁胺卡那、卡那霉素、諾氟沙星、環丙沙星、氧氟沙星、紅霉素、麥迪霉素、克林霉素、萬古霉素、氯霉素表現出敏感；而對呋喃唑酮、復方新諾明、頭孢他啶、多粘菌素B這4種常見抗生素耐藥（表2）。

表2 藥敏試驗結果Table 2 Test results of drug sensitivity

近年從健康家畜和微生態制劑中分離的糞腸球菌均表現出一定的耐藥性，說明在畜牧行業和飼料行業中糞腸球菌的耐藥性呈現上升趨勢。歐拉型藏羊源糞腸球菌EF1-mh株藥敏實驗結果表明在受試的30種抗菌藥物中，對苯唑西林、頭孢呋辛、頭孢氨芐、頭孢拉定、多西環素和米諾環素表現為中等敏感；對呋喃唑酮、復方新諾明、頭孢他啶、多粘菌素B耐藥；腸球菌的固有耐藥性主要是β-內酰胺類、克林霉素、氨基糖苷類、甲氧芐氨嘧啶-磺胺甲惡唑[11]。對于β-內酰胺類藥物的耐藥性是腸球菌的一個固有特性，糞腸球菌可能不產生β-內酰胺酶的特性，從而導致對頭孢他啶具有耐藥性。糞腸球菌EF1-mh株與石春衛等[15]從長春市雙陽地區某豬場28日齡健康仔豬新鮮糞便中分離的糞腸球菌，以及朱利霞等[19]從河北省圍場縣某牛場病死犢牛中分離出的糞腸球菌B2019的藥敏試驗結果有所不同，這可能是由于動物的品種和地理環境的差異性，來源于不同動物樣品的糞腸球菌在耐藥性方面存在差異。

2.4 抑菌試驗結果

腸球菌可以有效抑制腸道病原菌，維護宿主腸道健康。其中，糞腸球菌和屎腸球菌也屬于益生菌，具有益生的功能，對動物的生長和健康具有良好的作用。糞腸球菌作為一種益生菌，在醫學和食品工程領域得到廣泛應用[20]。糞腸球菌通過黏附于腸道表面形成保護屏障，可在腸道上皮細胞上形成生物膜，保護腸上皮細胞免受有害物質侵襲[18]，并且可產生有機酸、細菌素（acteriocins），包括腸溶素A和腸道菌素（enterocins）Gr17等抑菌物質，來調節腸道內環境，發揮益生作用[21-22]。這些細菌素，即所謂的腸道菌素，大多是由核糖體合成機制產生的一些小的陽離子抗菌肽，對于一些革蘭氏陽性腐敗菌和致病菌有抗菌活性[23]。研究表明，大多數細菌素只對親緣性較近的革蘭氏陽性菌效果好，此外一些細菌素也對特定的革蘭氏陰性菌有抑制作用，例如大腸桿菌和沙門氏菌，這可能與革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細胞壁成分有關，革蘭氏陽性菌細胞壁主要僅由肽聚糖組成，不能形成有效的屏障；而革蘭氏陰性菌外有一層磷脂膜和脂多糖結構，這使得抑菌物質不能輕易滲透細胞壁，有些細菌素還可以抑制某些病毒的生長[24-25]。糞腸球菌可產生一類特異性細菌素，其抗菌譜窄，能夠防止病原微生物接觸腸黏膜細胞。并且糞腸球菌還可產生具有廣譜抗菌特性的細菌素，對假單孢菌、沙門菌及志賀氏菌有較好的抑制作用。Hugas等[26]研究證實，糞腸球菌能夠有效抑制金黃色葡萄球菌生長。候璐[27]通過給斷奶仔豬中飼喂糞腸球菌，結果發現其糞便中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的數量減少。

本試驗與上述研究結果相符，如表3所示，糞腸球菌EF1-mh所產抑菌物不但對產氣莢膜梭菌有較強的抑制作用，且對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均有很好的抑制效果。具有抑菌能力的糞腸球菌上清會在牛津杯周圍形成一個透明的抑菌圈，抑菌圈的直徑越大，說明對應菌株對致病菌的抑制能力越強；不具備抑菌能力的糞腸球菌上清在牛津杯周圍沒有抑菌圈，細菌均勻生長。抑菌試驗結果表明，糞腸球菌EF1-mh株上清液可有效抑制腸道致病菌的生長，對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和產氣莢膜梭菌4株腸道致病菌都具有抑制作用，抑菌效果較好。其中產氣莢膜梭菌抑菌圈直徑最大，說明糞腸球菌EF1-mh對產氣莢膜梭菌抑菌能力最強。益生菌對致病菌的抑制作用是益生菌的一個重要益生特征，理想的益生菌菌株應該是分離自同源動物胃腸道，具有一定的耐受能力[28]。不同動物腸道中的菌群具有特異性，菌株的來源與使用對象一致，可以更好地發揮益生作用[29]，因此，從健康歐拉型藏羊腸道內容物中分離的糞腸球菌EF1-mh株具有很好的益生性，更易于在歐拉型藏羊腸道內定植并發揮作用，為后期開發歐拉型藏羊源微生態制劑提供了候選菌株。

表3 抑菌試驗結果Table 3 Antibacterial test results

3 結論

本實驗從健康的歐拉型藏羊腸道中分離得到了一株糞腸球菌EF1-mh，該菌株是無芽孢、無菌毛的革蘭氏陽性球菌，能分解麥芽糖、葡萄糖、果糖等，不能分解甘露醇、山梨醇、棉子糖、L-鼠李糖、阿拉伯糖等，具有L-精氨酸雙水解酶活性，膽汁七葉苷瓊脂指示劑結果呈黑色，不產生硫化氫，吲哚試驗、VP試驗呈陰性，不利用西蒙氏枸櫞酸鹽和葡萄糖酸鹽作為能源，不能還原硝酸鹽。糞腸球菌EF1-mh株具有較強的生長能力和較弱的產酸能力。糞腸球菌EF1-mh株對苯唑西林、頭孢呋辛、頭孢氨芐、頭孢拉定、多西環素、米諾環素表現出中度敏感；對呋喃唑酮、復方新諾明、頭孢他啶、多粘菌素B表現出耐藥，并且該菌株其上清液可明顯抑制腸道致病菌，其中對產氣莢膜梭菌的抑菌能力最強。