響應面法優化發酵香腸的低鈉復合鹽配方

王寧寧，馮美琴，孫 健,

（1.南京農業大學食品科學技術學院，國家肉品質量安全控制工程技術研究中心，江蘇南京 210095；2.金陵科技學院動物科學與食品工程學院，江蘇南京 210038）

發酵香腸是具有特殊的發酵風味和微生物穩定性的肉制品，是通過充分混合攪碎的瘦肉、動物脂肪、鹽、糖、發酵劑和各種香辛料，再進行灌腸、發酵、干燥和成熟而制成[1]。食鹽在肉制品的制作中不可或缺，它可以增強咸味、增加風味、防腐抑菌和提高產品持水性[2-3]。約2%～3%食鹽在制作初期加入到發酵香腸中，成品中的食鹽含量甚至達到6%[4]。目前人們膳食中有鈉鹽攝入量增加，甚至攝入過量的現象，原因是肉制品是食物中脂肪和食鹽的重要來源，而人們對肉制品的逐漸需求量增加[5-7]。許多研究表明，高鹽攝入是引發高血壓和心血管疾病的重要因素[5-6]。因此減鹽的同時保證產品理化特性和感官品質成為國內外學者的研究熱點。

目前常用來替代食鹽的有鉀鹽、鈣鹽和鎂鹽等[8]。氯化鉀（potassium chloride，KCl）與氯化鈉（sodium chloride，NaCl）性質相近，并且還未發現鉀攝入與高血壓的發病有直接關聯[6]，因此是目前使用最廣泛的替代鹽。Wu等[9]分別用40%和70%氯化鉀替代干腌熏肉中的氯化鈉，發現使用氯化鉀替代氯化鈉對蛋白的降解沒有顯著影響；鈣鹽也是肉制品中常用的替代鹽，鈣不僅是人體骨骼的主要成分，也在維持細胞功能等方面有作用[10]。Horita等[11]發現氯化鈣（calcium chloride，CaCl2）的添加降低了意式肉腸的乳液穩定性、蒸煮率、彈性和粘黏性，而使硬度增加。除此之外，鎂鹽也常用作肉制品中氯化鈉的替代物[12]。由于鉀鹽的大量替代氯化鈉會給產品帶來苦味和金屬味[13]，導致單一替代鹽的使用存在一定局限性，因此國內外學者將研究重點轉向多種食鹽替代物和風味增強劑混合使用降低食鹽添加量。風味增強劑本身不具有咸味，而是通過增強口腔器官對咸味的感知，來彌補減鹽帶來的咸味下降[14]。常用的風味增強劑有氨基酸類、核苷酸鹽類、咸味肽、酵母提取物等。甘氨酸（glycine, Gly）是一種風味增強劑，通常用于加工肉類調味料的制備，具有緩和酸味、掩蓋苦味，促進香味物質形成以及防腐功能[15-17]，因此在制作發酵香腸的過程中，可以通過加入甘氨酸來掩蓋氯化鉀帶來的苦味和發酵產生的過度酸味，以達到加強風味的目的[18]。

本研究以發酵香腸為原料，使用氯化鉀、氯化鈣和甘氨酸三種替代鹽替代香腸中的氯化鈉，結合感官評價、質構特性、水分含量綜合結果研究三種替代鹽對發酵香腸的影響，并以此為基礎利用響應面法進一步優化，得到發酵香腸替代鹽的最佳替代比例，以得到適合添加在發酵香腸中的低鈉復配鹽，在保證香腸品質的基礎上降低鈉含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌L.plantarumCD 101（NCBI編號為MG798695）、模仿葡萄球菌S.simulansNJ 201（NCBI編號為MG798688） 菌種由實驗室分離鑒定獲得；豬后腿肉、豬背膘、豬腸衣、白胡椒粉、姜粉、五香粉

南京蘇果超市；食鹽、葡萄糖 南通奧凱生物技術開發有限公司；異抗壞血酸鈉 鄭州拓洋實業有限公司；亞硝酸鈉 杭州龍山化工有限公司；MRS Brouth培養基、MRS Agar培養基、TSA培養基、TSB培養基 北京路橋技術股份有限公司；氯化鉀、氯化鈣、甘氨酸 河南豫中生物工程有限公司；實驗試劑 均為分析純。

TC 12E絞肉機 意大利Sirman公司；VF608灌腸機、真空攪拌機 德國Handtmann公司；KBF

240恒溫恒濕箱 德國Binder公司；質構儀 英國Stable Micro Systems公司；HVE-50自動高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司；SW-CJ-1F超凈工作臺蘇凈集團蘇州安泰公司；TS-5000Z電子舌 日本Insent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵劑的活化與制備L.plantarumCD 101的培養條件為37 ℃培養24 h；S.simulansNJ 201的培養條件為30 ℃培養24 h；分別活化3次后，取出濃度為107CFU/g的菌液，進行離心（10000×g，10 min，4 ℃），保留沉淀，加入適量無菌水進行離心洗滌，重復3次，最后重懸備用。

1.2.2 發酵香腸的制作 參考曹辰辰等[19]的方法，制作發酵香腸。基礎配方為：8份新鮮豬瘦肉與2份豬背膘混合，調味料以肉重為計算，添加量分別為蔗糖1%、葡萄糖1%、亞硝酸鈉0.015%、異抗壞血酸鈉0.05%、姜粉0.1%、五香粉0.1%、白胡椒粉0.1%，兩種發酵劑的菌液濃度均為107CFU/g。食鹽含量根據試驗設計添加，其中對照組食鹽為2%。

工藝流程：原料肉處理→絞肉→加入調料→低溫腌制→接菌攪拌→灌腸→恒溫發酵→干燥成熟

工藝要點：剔除豬后腿瘦肉中的筋膜，切成均勻長條狀，漂洗后4 ℃冷藏待用；豬背膘切成長薄片，貼至盆壁方便取出，放置于-20 ℃預凍待用。絞肉機選擇孔徑為10 mm的篩板，將瘦肉和背膘肉分別攪碎后，根據質量比8:2混合。按照比例加入各種調味料和輔料并攪拌均勻，置于4 ℃腌制24 h。加入提前活化的發酵劑，攪拌均勻后進行灌腸。灌腸直徑約為3.5 cm，灌腸時要掌握合適的松緊度，既不能灌得過于飽滿而脹破腸衣，也不能灌得過松導致腸體松散。發酵及干燥條件為：30 ℃、相對濕度80%快速發酵24 h；15 ℃、相對濕度75%緩慢發酵3 d；12 ℃、相對濕度72%干燥；以灌腸完畢為0 d，干燥后熟至第21 d得到發酵香腸成品。

1.2.3 單因素實驗 以感官評價、質構、水分含量為評價指標，探究氯化鉀、氯化鈣和甘氨酸的不同替代量（以食鹽添加量2%計算）對發酵香腸的影響，確定三種替代鹽的最佳添加量，單因素實驗中各因素的替代水平如表1所示。

表1 單因素實驗中各因素水平設計Table 1 Levels of independent variables used for single factor test

1.2.4 響應面試驗設計 結合單因素實驗結果，選擇每個因素的最佳替代比，采用Design-Expert 8.06軟件，根據Box-Behnken中心組合設計原理，將感官評價和咸度值作為響應值，進行3因素3水平共17個點響應面優化試驗，確定發酵香腸中替代鹽的最佳替代比。因素與水平見表2。

表2 響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface design

1.2.5 感官評價 感官評價參照曹辰辰[19]的方法稍作修改。感官評價小組由14名經驗豐富的食品專業人員（7男7女）組成，培訓方法按照GB/T 22210-2008《肉與肉制品感官評定規范》[20]進行。如表3所示，感官評價分為顏色（20%）、氣味（20%）、組織狀態（30%）以及滋味（30%）4個部分，評判標準見表2。

表3 發酵香腸感官評分標準Table 3 Criteria for sensory evaluation of fermented sausages

1.2.6 質構分析 將發酵香腸切成高約為10 mm的圓柱，去除腸衣。使用P50 A探頭，測定參數為：50 kg load cell，測前速度為2 mm/s，測試速度為5 mm/s，測后速度為2 mm/s，壓縮率為50%。測定結果選取硬度、內聚性、彈性和咀嚼性進行分析[21]。

1.2.7 水分含量 按照GB 5009.3-2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》測定[22]。

1.2.8 電子舌分析 參考鞏洋[23]的方法略有調整。稱?。?0.0±1.0）g發酵香腸肉糜與200 mL去離子水充分攪拌均勻，超聲處理15 min。使用紗布及濾紙過濾后，取約80 mL濾液進行電子舌分析。使用電子舌味覺分析系統，每個樣品數據采集進行4次，第一組數據舍去。本實驗選取咸度值進行分析。

1.3 數據處理

每個處理設置3個重復，采用Design-Expert 8.06軟件進行響應面試驗設計與分析，采用SAS 9.1軟件中的Duncan’s Multiple-Range Test進行數據的顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 氯化鉀替代比對發酵香腸的影響

2.1.1.1 氯化鉀替代比對發酵香腸感官評價的影響

如表4所示，隨著氯化鉀替代比例的增加，發酵香腸的顏色、氣味、組織狀態、滋味和總分均呈現先增加后減少的趨勢。當氯化鉀替代比例為40%時，產品組織狀態得分顯著降低（P＜0.05），這與Marcio等[24]的研究結果一致，并且此時發酵香腸出現苦味。當替代比為50%時，感官評價總分顯著降低（P＜0.05），苦味和金屬味顯著，Wu等[9]也有相同的發現。綜合各個指標，選擇30%為氯化鉀最佳替代比例。

表4 氯化鉀替代比對發酵香腸感官評價的影響（分）Table 4 Effect of KCl substitution on sensory score of fermented sausages (scores)

2.1.1.2 氯化鉀替代比對發酵香腸質構的影響 如表5所示，隨著氯化鉀替代量的增加，產品的硬度、彈性、內聚性和咀嚼性呈現先增加后降低的趨勢，這與Wu等[9]的研究結果類似。30%替代組的硬度顯著高于其他替代組（P＜0.05），與20%替代組無顯著差異（P＞0.05）；30%替代組的內聚性和硬度顯著高于其他替代組（P＜0.05）。硬度和內聚性是表征香腸切片性的重要特征[25]，根據實驗結果可知，30%替代組的切片性最好，同時咀嚼性最好，這與感官評價結果一致，說明質構結果與感官評價之間存在良好相關性，避免了感官評價過程中的主觀性影響。因此選擇30%作為氯化鉀的最佳替代比例。

表5 氯化鉀替代比對發酵香腸質構特性的影響Table 5 Effect of KCl substitution on textural properties of fermented sausages

2.1.1.3 氯化鉀替代比對發酵香腸水分含量的影響

如圖1所示，經過發酵成熟，所有組別的發酵香腸水分含量均降低到30%以下，低水分含量有利于抑制發酵香腸中微生物的活動，更有利于香腸貯藏[26]。在本實驗中，替代組的水分含量變化趨勢為先增加后下降，這與宗麗娜等[27]的研究結果相似。當氯化鉀替代比例增加到30%時，水分含量顯著下降（P＜0.05），原因是氯化鈉可以促進肌肉蛋白水解，使得肌原纖維束膨脹，從而導致肌原纖維之間的結構更加疏松，有提高持水性的功能[28]，當氯化鈉被大量替代時，水分含量會降低。30%～50%替代組的水分含量之間無顯著差異（P＞0.05），但綜合3個指標的結果，選擇使用30%氯化鉀替代氯化鈉的綜合效果最佳。

圖1 氯化鉀替代比對發酵香腸水分含量的影響Fig.1 Effect of KCl substitution on water content of fermented sausages

2.1.2 氯化鈣替代比對發酵香腸的影響

2.1.2.1 氯化鈣替代比對發酵香腸感官評價的影響

如表6所示，隨著替代量的增加，發酵香腸的顏色、氣味、組織狀態、滋味和總分呈現下降趨勢。根據實驗結果可知，10%替代組的顏色、組織狀態、滋味和總分均顯著高于其他替代組（P＜0.05），這與Gap等[29]用研究結果相似，其發現氯化鈣替代低脂豬肉乳化腸中的氯化鈉時，香腸的整體接受度與氯化鈣的替代量呈反比。因此選擇10%為氯化鈣對最佳替代比例。

需要注意的是思維導圖的制作應當根據學期授課安排，圍繞教學目標，緊扣教學大綱，根據學生實際情況，合理安排章節，突出教學的重點和難點，并充分挖掘無機化學與藥學專業的緊密聯系。

表6 氯化鈣替代比對發酵香腸感官評價的影響（分）Table 6 Effect of CaCl2 substitution on sensory score of fermented sausages (scores)

2.1.2.2 氯化鈣替代比對發酵香腸質構的影響 由表7可知，隨著氯化鈣替代量的增加，產品的硬度、彈性、內聚性以及咀嚼性呈現先減小后增大的趨勢，這與姚崢[30]的研究結果相似。根據實驗結果，替代組的彈性均高于對照組，說明氯化鈣可以提高產品彈性，但各替代組之間彈性沒有顯著區別，這與Alfonso等[31]的研究結果相似；10%替代組的硬度、內聚性和咀嚼性高于其他處理組，所以形成的切片狀態和感官評分最佳，因此選擇10%作為氯化鈣的最佳替代比。

表7 氯化鈣替代比對發酵香腸質構的影響Table 7 Effect of CaCl2 substitution on textural properties of fermented sausages

2.1.2.3 氯化鈣替代比對發酵香腸水分含量的影響

如圖2所示，各替代組水分含量逐漸增加，均高于對照組，原因是氯化鈣使離子強度增強，親水蛋白之間的作用力增大，結合了更多自由水使水分含量增加[32]。產品含水量與產品的彈性有關，水分含量越高，彈性越大[31]，這也驗證了質構分析中替代組彈性高于對照組的結果。有報道表明氯化鈣適宜用較小比例替代乳化腸中的氯化鈉[29]，綜合感官評分、質構和水分含量的結果，選擇10%為氯化鈣的最佳代替比例。

圖2 氯化鈣替代比對發酵香腸水分含量的影響Fig.2 Effect of CaCl2 substitution on water content of fermented sausages

2.1.3 甘氨酸替代比對發酵香腸的影響

2.1.3.1 甘氨酸替代比對發酵香腸感官評價的影響

如表8所示，甘氨酸替代量對氣味沒有顯著影響（P＞0.05），但隨著替代量的增加，發酵香腸的顏色、組織狀態、滋味和總分降低。作為一種甜味劑，甘氨酸的加入適當減弱了發酵香腸的酸味，更加適合普遍消費者的口味，因此10%替代組的滋味得分最高，但當替代比增加到20%時，香腸滋味得分顯著下降（P＜0.05），原因是發酵香腸的特殊風味被嚴重削弱，當替代比增加到40%，出現明顯甜味，影響發酵香腸的感官品質，這說明甘氨酸在較小替代量時有加強香腸風味的作用，但替代量增大時反而會削弱發酵香腸的特殊風味，這與Gou等[33]的研究結果一致。綜合各項指標得分，選擇10%為甘氨酸的最佳替代比例。

表8 甘氨酸替代比對發酵香腸感官評價的影響（分）Table 8 Effect of Gly substitution on sensory score of fermented sausages (scores)

2.1.3.2 甘氨酸替代比對發酵香腸質構的影響 如表9所示，當甘氨酸替代量為10%時，產品質構特性均優于對照組，說明甘氨酸在一定程度上能夠提高香腸的質構特性；但在各替代組之間，香腸的硬度、彈性、內聚性呈現逐漸降低趨勢。10%替代組的硬度和內聚性最大，切片特性最好，并且咀嚼性最好，與感官評分結果相一致，說明質構測定與感官評價具有良好相關性。選擇10%為甘氨酸的最佳替代比例。

表9 甘氨酸替代比對發酵香腸質構的影響Table 9 Effect of Gly substitution on textural properties of fermented sausages

2.1.3.3 甘氨酸替代比對發酵香腸水分含量的影響

如圖3所示，隨著替代量的增加，分水含量呈現先增加后減少的趨勢。10%和50%替代組的水分含量與對照組接近且無顯著差異，20%～40%替代組水分含量顯著高于對照組（P＜0.05），水分含量的變化可能是由于甘氨酸影響了香腸的pH，使得蛋白質之間的靜電斥力改變，纖維間距改變，從而蛋白和水的相互作用改變，引起香腸保水性的變化[25]。前人研究表明，甘氨酸單一替代的適宜比例為10%～20%[34-35]，因此選擇10%為甘氨酸的最佳替代比例。

圖3 甘氨酸替代比對發酵香腸水分含量的影響Fig.3 Effect of Gly substitution on water content of fermented sausages

2.2 響應面試驗結果

根據Design-Expert V8.0.6軟件中的Box-Behnken中心組合設計原理，以單因素實驗得出的最佳替代比為基礎，以A氯化鉀替代比（%）、B氯化鈣替代比（%）和C甘氨酸替代比（%）為自變量，以感官評價和咸度值為響應指標設計試驗，既可以參考消費者的喜好感受，同時使用電子舌直觀地表示出各個組合的咸度值大小，避免感官評價帶來的主觀性影響。試驗組合及結果如表10所示。

表10 響應面試驗設計方案及結果Table 10 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.1 響應面優化試驗結果及方差分析 利用Design-Expert軟件對感官評分及咸度值的實驗結果進行擬合分析后，得到的結果如表10所示。

對感官評分結果進行擬合分析后，得到的二次多項方程為：Y=84.54-0.76A-3.28B-1.34C-0.80AB-1.37AC-0.073BC-3.32A2-2.51B2-1.36C2。R2=0.9325，校正系數R2Adj=0.8457，說明該試驗具有較好擬合性，實驗誤差小，對樣品感官評分的預測準確性高。感官評分的回歸方差分析結果如表11所示，模型極顯著（P＜0.01），且失擬項不顯著（P＞0.05），說明模型有效可用。通過F檢驗可知，三種因素對發酵香腸的感官評分影響順序為：B（氯化鈣替代比）＞C（甘氨酸替代比）＞A（氯化鉀替代比），并且一次項B和二次型A2、B2對模型極顯著（P＜0.01），一次項C對模型影響顯著（P＜0.05）。

表11 感官評分的回歸方程方差分析結果Table 11 Analysis of variance for sensory score

對咸度值進行擬合分析后，得到的二次多項方程為：Y=2.41-0.19A-0.22B-0.45C+0.14AB+0.22AC+0.032BC-0.58A2-0.33B2+9.000E-003C2。R2=0.9089，校正系數R2Adj=0.7919，說明該試驗具有良好擬合性，誤差較小，可以對樣品的咸度值進行預測。咸度值的回歸方差分析結果如表12所示，模型極顯著（P＜0.01）、失擬項不顯著（P＞0.05），說明模型有效可用。通過F檢驗可知，三種因素對發酵香腸的感官評分影響順序為：C（甘氨酸替代比）＞B（氯化鈣替代比）＞A（氯化鉀替代比），并且一次項C和二次型A2對模型極顯著（P＜0.01），一次項B、二次項B2對模型影響顯著（P＜0.05）。

表12 咸度值的回歸方程方差分析結果Table 12 Analysis of variance for salinity value

2.2.2 各因素間的交互作用分析 利用軟件對結果進行擬合分析后，得到響應面圖如圖4所示。三維曲面圖的弧度可以說明因素對響應指標的影響程度，弧度越大，影響越大[35]。如圖4所示，各因素之間有不同程度的交互作用，氯化鉀和甘氨酸的交互作用最強，其次是氯化鉀和氯化鈣的交互作用，氯化鈣和甘氨酸的交互作用對感官評分的影響最弱，這與方差分析的結果相符。感官評分隨著氯化鉀、氯化鈣和甘氨酸替代比的增加呈現先增加后下降的趨勢。各因素間交互作用對咸度值的影響如圖5所示，鉀化鈣和甘氨酸的交互作用最強，其次是氯化鉀和氯化鈣，氯化鈣和甘氨酸之間的交互作用最弱。

圖4 各因素交互作用對感官評分影響的響應面圖Fig.4 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on sensory score

圖5 各因素交互作用對咸度值影響的響應面圖Fig.5 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on salinity value

綜上所述，按照咸度值和感官評分最高為優化條件，利用軟件進行優化，得到各替代鹽替代發酵香腸中氯化鈉的最佳替代比例為：氯化鉀29.75%、氯化鈣7.13%、甘氨酸5.40%，預測感官得分為85.61，咸度值2.88。

2.2.3 驗證試驗 考慮到實際生產的可操作性，調整參數為：氯化鉀30%、氯化鈣7%、甘氨酸5%（以對照組食鹽重計算），以2%氯化鈉為對照，重復3次進行驗證。最終得到產品的感官評分平均值為85.37，咸度值平均值為2.90，均與模型理論值相近，說明該模型能夠對實際值進行預測，應用于發酵香腸替代鹽配方的優化。

3 結論

本實驗通過感官評價、質構特性和水分含量的結果探究氯化鉀、氯化鈣、甘氨酸以不同比例替代氯化鈉時對發酵香腸品質的影響。根據單因素實驗，得到三種替代鹽的最佳替代比例分別為：氯化鉀30%、氯化鈣10%、甘氨酸10%。在單因素實驗基礎上以感官評分和咸度值為響應指標進行響應面優化試驗，以減少單一替代鹽對發酵香腸品質造成的負面影響，最終得到發酵香腸低鈉復配鹽的最佳替代配方為：氯化鉀30%、氯化鈣7%、甘氨酸5%，此時模型預測預測感官得分為85.61，咸度值2.88。驗證試驗表明，此條件下發酵香腸感官評分為85.37，咸度值為2.90，鈉含量為798.05 mmol/L，比對照組的1244.79 mmol/L降低了35.89%，說明本實驗建立的模型能夠較好的應用于發酵香腸低鈉復配鹽的開發，使用該低鈉復配鹽制作發酵香腸，不僅可以降低鈉含量，還可以保持發酵香腸的感官品質，從而為發酵香腸的生產提供更健康的新工藝，開發滿足不同人群需求的發酵香腸產品。