新型工業化生產低溫腌制大頭菜揮發性風味物質分析

張鈺麟，陳泓帆，趙志平,2, ，康馨樾，聶 鑫，白 婷，王 衛，張佳敏，羅淮良

（1.成都大學肉類加工四川省重點實驗室，四川成都 610106；2.宜賓學院固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓 644000；3.成都醫學院基礎醫學院，四川成都 610500；4.自貢市泰福農副產品加工廠，四川自貢643101）

大頭菜又名芥菜，是醬腌菜常用原料，是四川四大醬腌菜之一，深受人們的喜愛。大頭菜具有豐富的營養物質，包括維生素、糖類、蛋白質和礦物質等。在綠色蔬菜中，大頭菜的蛋白質和氨基酸含量較高，且富含維生素A、維生素C和胡蘿卜素。大頭菜每100 g可食部分含蛋白質8.7 g、脂肪0.7 g、粗纖維素2.7 g、碳水化合物19.5 g、鈣214 mg、磷49 mg、鐵8.2 mg[1]。大頭菜具有潤腸通便、促進消化、利尿消腫等功效[2]。大頭菜生食味辣，熟化后味苦，腌制后的大頭菜口感脆爽，入口咸香，回味甘甜，具有獨特的風味，受到消費者青睞。

大頭菜中的硫代葡萄糖苷可在分解后促進人體吸收，Macleod等[3]認為大頭菜中由硫代葡萄糖苷產生的異硫氰酸酯是大頭菜中的重要香氣物質。洪冰等[4]比較接種發酵和自然發酵的大頭菜風味發現，接種發酵產生的揮發性風味物質高于自然發酵。郭壯等[5]使用電子舌測得不同地區傳統大頭菜的滋味，發現腌制大頭菜的滋味差異來源于咸味、后味B和酸味三個指標。溫度是影響食品風味形成的重要因素[6-7]。洪冰[8]研究發現，大頭菜最適發酵溫度為27 ℃，此溫度下發酵的大頭菜的滋味更加鮮美，香氣更加純正濃郁。蘇揚等學者研究發現，泡菜的風味形成與乳酸發酵、乙醇發酵、醋酸發酵有關[9]。乳酸菌是大頭菜腌制過程中的主要優勢菌[10]，在中溫環境下，容易過酸和過熟。低溫可使發酵緩慢，細菌代謝周期長，代謝過程反應完全[11]。低溫發酵在酸奶、面包、果酒等中都有較多研究和應用。低溫發酵可使泡白菜揮發性成分豐富，風味比中溫發酵的泡白菜更佳[12]。歐陽晶等[13]對臘八豆進行低溫發酵，通過測定不同時期的揮發性風味物質，證實了低溫發酵產生的風味物質與傳統發酵風味物質成分基本相同，但低溫可使風味物質聚集更加穩定，穩定產品質量。鄧山鴻[14]在臍橙果酒的研究中發現，低溫發酵有助于平衡酒體中各香氣成分。楊仁琴[15]比較了低溫長時間發酵和短時常規發酵酸乳，發現低溫長時間發酵酸乳的乙醛和乙酰化合物含量更高，風味更佳。綜上所述，低溫對發酵產品的風味形成與聚集有較大的正向影響。

傳統大頭菜多為高鹽常溫腌制，在腌制過程中使用了大量的鹽，腌制后需用大量的清潔水脫鹽，不僅增加了生產成本，而且帶來了一定程度的環境污染，并且脆度較低。此外，傳統大頭菜產品含鹽量較高，不符合當下低鹽化消費理念。低溫腌制可解決傳統大頭菜腌制用鹽量高、造成環境污染和脆度低的技術難題。本研究在SPME-GC-MS的基礎上，結合ROAV值和PCA分析了工業化生產的不同低溫腌制（-1～5 ℃和6～8 ℃）大頭菜的風味物質的種類和含量，以期為工業化低溫大頭菜腌制工藝的優化提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低溫腌制大頭菜 自貢市泰福農副產品加工廠提供。

BCD-452WDPF冷藏冰箱 青島海爾集團；5977A-7890B型氣相色譜-質譜聯用儀（含PAL3自動進樣器） 美國安捷倫公司；賽多利斯萬分之一天平 上海民橋精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 低溫腌制大頭菜加工工藝 將大頭菜用冷水清洗，去除泥沙和根須后進行自然風干20～40 d；自然風干后，將大頭菜進行分切成2～3 mm厚連接手撕片；分切后，利用60±2 ℃的水進行清洗和浸泡10 min，然后把大頭菜取出利用熱風振動機在35～40 ℃條件下熱風振動15 min，將大頭菜干燥。將大頭菜和鹽（2.5%～3%）放入攪拌機，慢速攪拌3～9 min，裝入500 kg壇子，裝滿后在0～5 ℃條件下腌制1～2 d，進行第一次腌制。完成后，將大頭菜取出，再次放入攪拌機，并且加入4%的糖和0.5%～1.5%的鹽，慢速攪拌3～9 min，完成后取出；將大頭菜裝入50 kg壇子，裝滿密封后放入冷庫中分別進行-1～5 ℃和6～8 ℃低溫腌制60 d，以此樣品作為半成品進行風味分析。半成品經過調味后加工為成品，低溫腌制是大頭菜自身風味的形成階段，故采用此階段的樣品進行風味分析。

1.2.2 GC-MS檢測 取-1～5 ℃和6～8 ℃低溫腌制大頭菜，大頭菜中間部位寬度為1 cm，切碎成粒徑大約為1 mm的顆粒；稱取3 g顆粒置于15 mL的頂空瓶中密封，設置CTC自動進樣器對樣品的前處理條件如下：加熱箱溫度75 ℃，加熱時間45 min，樣品抽取時間20 min，解析時間5 min。

色譜條件：參照張旭的方法，稍作改進[16]。HP-5MS UI色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；壓力32.0 kPa；流速1.0 mL/min；載氣為H e氣，不分流進樣；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：起始溫度40 ℃保持1 min，以5 ℃ /mi n升至8 0℃，再以 3℃ /min升至160 ℃，保持1 min，再以20 ℃ /mi n升至200 ℃保持1 min。

質譜條件：電子電離源（EI）；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃；檢測器電壓350 V；質量掃描范圍（m/z）50550。

定性：對化合物進行分析，將得到的數據在儀器的NIST 14.L譜庫中進行檢索和匹配，選擇匹配度高于80%的物質。參考已報道的文獻對各色譜峰進行人工解譜并且結合保留指數（RI），取正構烷烴（C10～C25）混標，參照上述方法進行GC-MS分析；利用每個正構烷烴的保留時間，結合公式計算待測組分的RI值。

式中：n為碳原子數；tx為待測組分的保留時間min；tn為碳原子數為n的正構烷烴保留時間，min tn+1為碳原子數為n +1的正構烷烴保留時間，min。

定量：對總離子流量色譜圖用峰面積歸一化定量，得出各組分的相對含量。

1.2.3 特征揮發性風味物質的評價 為了評價各種揮發性物質對樣品風味的影響，采用相對氣味活度法（ROAV法）[17]，使得樣品風味貢獻程度最大的物質ROAVs=100，樣品中其他風味物質的ROAV值可通過以下公式計算：

式中：ROAVa是揮發性物質的相對氣味活度值；C%a為各揮發性成分的相對含量；C%stan為對樣品風味貢獻程度最大物質的相對含量；Tstan為對樣品風味貢獻程度最大物質的感官閾值；Ta為各揮發性成分的感官閾值。對于所有的風味物質，0≤ROAV≤100。0.1≤ROAV＜1，對樣品的風味起修飾作用；ROAV≥1的物質為樣品的主體風味物質，對樣品的風味貢獻顯著。ROAV值越大，則說明此物質對樣品風味貢獻越大。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2019進行數據統計，并且以各種風味物質作為變量，采用IBM SPSS Statistics 25.0進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 揮發性風味物質的測定分析

使用SPME-GC-MS對兩種不同新型低溫腌制大頭菜的揮發性風味物質進行分析，其色譜圖結果如圖1所示。

腌制溫度的不同使得兩種低溫腌制大頭菜揮發性風味物質種類以及含量都有所差異。-1～5 ℃低溫腌制的大頭菜風味物質包含醇類物質3種、酯類物質3種、烯類物質1種、腈類物質1種、酮類1種、醚類1種，平均相對含量分別為2.46%、23.11%、1.90%、5.88%、23.65%、1.20%。6～8 ℃低溫腌制的大頭菜風味物質包含醇類物質6種、酯類物質3種、烯類物質2種、腈類物質1種、醛類物質1種、酸類物質1種、酮類物質1種、醚類物質1種，平均相對含量分別為12.11%、16.65%、3.86%、3.52%、0.23%、0.38%、1.46%、1.20%。

腌制溫度升高后，大頭菜中的揮發性風味物質呈現上升的趨勢。兩種大頭菜共有的揮發性物質包括芳樟醇、苯乙醇、桉葉油醇、2-苯基乙基異硫代氰酸酯、2-苯乙基異氰酸酯、對二甲苯、D-檸檬烯、3-甲基異噻唑、茴香腦、2,4,6-三甲基吡啶、左旋樟腦、1-苯基-3-（2-羥乙基）硫脲、苯代丙腈。苯乙醇、異硫氰酸仲丁酯、4-異丙基甲苯、2-正戊基呋喃為-1～5 ℃低溫腌制大頭菜所獨有的風味物質；苯乙醇具有強烈的果香、異硫氰酸仲丁酯廣泛存在于芥末、蘿卜、山葵中，其只在-1～5 ℃中被檢出，能夠賦予-1～5 ℃低溫腌制大頭菜獨特的芥末、橡膠氣味[18]，十字花科蔬菜加工產品中辛辣風味是由原料中硫代葡萄糖苷在加工過程中，因細胞破損而在硫代葡萄糖酶催化下水解產生異硫氰酸酯類所賦予[19]，Blazevic等[20]利用GC-MS技術對青海月桂種子揮發性分解產物異硫氰酸酯進行了定性和定量分析，發現溫度越高使異硫氰酸酯含量越低，這與本研究結果相似。6～8 ℃低溫腌制大頭菜中未檢出異硫氰酸酯，可能是因為硫代葡萄酶因溫度升高而逐漸失活。3-甲基異噻唑相對含量由-1～5 ℃低溫腌制大頭菜中的23.65%下降到6～8 ℃低溫腌制大頭菜中的1.46%；其是一種肉類香精，香味特征為烤肉香[21]，主要是美拉德反應中間產物和含硫氨基酸降解產物之間發生反應[22]。1-辛烯-3-醇、4-萜烯醇、α-松油醇、螺[2.4]庚-4,6-二烯、P-傘花烴、1-亞甲基-4-（1-甲基乙烯基）環己烷、壬酸、苯乙醛、甲氧基苯肟、3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇甲酸酯是6～8 ℃低溫腌制大頭菜特有的風味物質。亞油酸在脂肪氧合酶催化下產生過氧化氫，經脫氫成酮再被酶轉化成1-辛烯-3-醇，賦予6～8 ℃低溫腌制大頭菜獨特的蘑菇香氣[23]。朱羽堯等[24]通過對大紅袍芳香物質含量及組成分析發現，4-萜烯醇和桉葉油醇的含量受溫度影響較大，比較兩種物質化學成分發現，4-萜烯醇可通過自身環化反應從而生成桉葉油醇。壬酸作為6～8 ℃低溫腌制大頭菜唯一酸類物質，能夠賦予其油香，有研究證實壬酸可在級聯酶的作用下，由不飽和脂肪酸轉化而來[25]。通過對上述檢測出的揮發性風味物質進行分類以及采用峰面積歸一法計算各種風味物質的相對含量，結果如表1所示。

表1 低溫腌制大頭菜揮發性風味物質種類及含量Table 1 Varieties and contents of volatile flavor compounds in kohlrabi pickled at low temperature

2.2 主體風味物質的ROAV分析

樣品的總體風味往往是由相對含量以及感官閾值共同決定的。相對含量高并且感官閾值低的物質對樣品整體風味貢獻較大。但是不同化合物的閾值不同，某些相對含量較低的物質由于閾值較低也對樣品風味貢獻較大[27]。參考文獻[16,28]以及結合《化合物嗅覺閾值匯編》，共找到17種揮發性風味物質的感官閾值（見表2），分別計算兩種低溫腌制大頭菜每種揮發性風味物質相對含量對感官閾值的比值，比較大小后可以定義苯代丙腈為-1～5 ℃低溫腌制大頭菜風味貢獻最大的物質（ROAV=100），1-辛烯-3醇為6～8 ℃低溫腌制大頭菜中風味貢獻最大的物質（ROAV=100）。結合相對含量以及感官閾值，采用ROAV法對兩種大頭菜的揮發性風味物質進行分析，以進一步確定關鍵性的風味物質。兩種大頭菜中的風味物質ROAV值如表2所示。

表2 大頭菜揮發性物質相對氣味活度值Table 2 Relative odour activity value of volatile flavor compounds in low-temperature pickled mustard roots

兩種低溫腌制大頭菜一共確定12種關鍵性風味物質，其中-1～5 ℃低溫腌制大頭菜共有9種，分別為異硫氰酸仲丁酯、2-正戊基呋喃、D-檸檬烯、桉葉油醇、芳樟醇、苯乙醇、苯代丙腈、茴香腦、2-苯基乙基異硫代氰酸酯。6～8 ℃低溫腌制大頭菜共有10種，分別為1-辛烯-3-醇、D-檸檬烯、桉葉油醇、苯乙醛、芳樟醇、苯乙醇、苯代丙腈、壬酸、茴香腦、2-苯基乙基異硫代氰酸酯。

醇類物質為兩種低溫腌制大頭菜主要的風味物質，主要由酵母菌發酵產生[29]，多來源于不飽和脂肪酸的氧化降解。醇類物質的感官閾值較高，但是對香氣的組成起關鍵性作用，可以與有機酸發生酯化反應，從而生成可賦予食品果香以及甜香的酯類物質[30]。腌制溫度升高后，醇類物質呈現上升的趨勢。1-辛烯-3醇隨著溫度的升高在6～8 ℃低溫腌制大頭菜中被檢出，且ROAV=100，說明1-辛烯-3醇是6～8 ℃低溫腌制大頭菜中風味貢獻較大的物質之一。另外，桉葉油醇、芳樟醇、苯乙醇也對兩種低溫腌制大頭菜的風味貢獻較大，它們分別呈現出樟腦香、花香、焦香-杏仁香。

腈類物質是十字花科蔬菜特有的揮發性風味成分[31-32]，它是通過芥子酶的催化活性降解硫代葡萄糖苷而產生的[33-34]。苯代丙腈作為唯一腈類物質在兩種低溫腌制大頭菜中ROAV值都偏大，其在-1～5 ℃大頭菜中ROAV為100、在6～8 ℃低溫腌制大頭菜ROAV為32.89。它是-1～5 ℃低溫腌制大頭菜貢獻率最大的風味物質。

異硫氰酸酯是兩種大頭菜中主要的酯類物質，是一種化學刺激物，具有獨特的特性，可引起熱感、灼熱感和刺激性氣味[35-36]。劉璞等發現榨菜腌制品自身的香氣主要來自于異硫氰酸酯類以及腈類物質[37]。

2.3 關鍵性風味物質的主成分分析

采用主成分分析法區分揮發性風味物質。提取ROAV ≥1的關鍵性風味物質，根據特征值不小于1的原則，得出兩個主成分，如表3所示。兩個主成分的貢獻率分別為85.33%、12.40%，累計貢獻率為97.73%。主成分分析累計貢獻率一般達到80%，就可以代表絕大部分信息[38]。

表3 主成分特征值及貢獻率Table 3 Principal component characteristic value and contribution rate

表4 是因子載荷矩陣，它反映的是各種揮發性風味物質對兩個主成分的重要程度。對PC1貢獻較大的揮發性風味物質主要有苯乙醇、桉葉油醇、1-辛烯-3-醇、2-苯基乙基異硫代氰酸酯、異硫氰酸仲丁酯、D-檸檬烯、壬酸、苯乙醛、2-正戊基呋喃、苯代丙腈；對PC2貢獻較大的有芳樟醇、D-檸檬烯、茴香腦、苯乙醛。

表4 載荷矩陣Table 4 Load matrix

以PC1（85.33%）、PC2（12.40%）建立主成分載荷圖以及兩種大頭菜的得分圖（圖2），兩個主成分可以反映全部信息的97.73%，提取較為全面。所有的揮發性風味物質分布在第一象限、第二象限、第四象限。離橫坐標越遠則說明對主成分1的貢獻越大，離縱坐標越遠的點對主成分2的貢獻越大。苯乙醇是對主成分1貢獻最大的揮發性風味物質，呈現出果香、玫瑰香氣[39]。壬酸、1-辛烯-3醇也是對主成分1貢獻較大的風味物質，1-辛烯-3醇又稱蘑菇醇[40]呈現出強烈的蘑菇-壤香[21]。此外，1-辛烯-3醇還可以作為醫藥原料[41]，壬酸呈現出油香味。因此，第一主成分主要反映大頭菜的果香、蘑菇香以及油香。對第二主成分（12.40%）貢獻較大的揮發性物質有茴香腦、芳樟醇、D-檸檬烯，它們分別呈現大茴香、鈴藍香、花香氣，所以第二主成分主要反映的是大頭菜的茴香、鈴藍香以及花香。由圖2B可知，兩種低溫腌制大頭菜在PC1以及PC2上得分具有差異，說明腌制溫度的升高導致低溫腌制大頭菜風味有所改變。-1～5 ℃低溫腌制大頭菜與PC2呈高度正相關，6～8 ℃大頭菜與PC1呈高度的正相關。

圖2 大頭菜主成分載荷圖（A）及兩種腌制溫度大頭菜的得分圖（B）Fig.2 Principal component load diagram and scores of lowtemperature pickled mustard roots

3 結論

SPME-GC-MS分析和ROAV值數據表明，-1～5 ℃和6～8 ℃低溫腌制大頭菜的揮發性風味物質主要包括醇類、酯類、烯類和腈類，6～8 ℃低溫腌制大頭菜較-1～5 ℃低溫腌制大頭菜的關鍵性風味物質更多。腈類是-1～5 ℃低溫腌制大頭菜貢獻最大的風味物質，而醇類是6～8 ℃低溫腌制大頭菜貢獻最大的風味物質。PCA分析表明腌制溫度升高導致低溫腌制大頭菜風味發生改變。基于代謝組學和微生物多樣性分析揭示溫度影響低溫腌制大頭菜風味形成的機理將成為未來研究重點方向。本研究為工業化生產低溫腌制大頭菜生產工藝的進一步優化提供了理論依據。