白芍總苷對(duì)高尿酸血癥腎損害大鼠腎臟的保護(hù)作用

劉冬戀，秦 琴 ，楊 婷，何欣宇，張雨晴，王玉江

（1.成都醫(yī)學(xué)院四川養(yǎng)老與老年健康協(xié)同創(chuàng)新中心，四川成都 610500；2.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川成都 610500）

目前，國(guó)內(nèi)外高尿酸血癥的患病率和發(fā)生率都在逐年增高，僅中國(guó)患者已達(dá)1.2億[1]。對(duì)我國(guó)5376名老年居民抽樣調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)老年人高尿酸血癥患病率為13.1%，尿酸水平和高尿酸血癥患病率均隨年齡增長(zhǎng)而升高[2]。高尿酸血癥是指體內(nèi)嘌呤代謝紊亂，尿酸生成過多或排出過少，引起血尿酸升高，超出血漿正常濃度。高尿酸血癥不僅在高血壓、心房顫動(dòng)、心力衰竭、冠心病和心血管死亡等心血管疾病的發(fā)生中發(fā)揮作用，而且也是腎臟疾病發(fā)生和發(fā)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3-4]。目前治療高尿酸血癥的西藥普遍存在不良反應(yīng)，例如別嘌醇會(huì)引起嚴(yán)重的超敏反應(yīng)，腎功能不全者患者只能由小劑量開始治療，在治療期間還應(yīng)密切觀察相關(guān)不良反應(yīng)發(fā)生情況，及時(shí)給予干預(yù)。此外，臨床試驗(yàn)表明大約40%～50%的患者單獨(dú)使用別嘌醇達(dá)不到降低尿酸到目標(biāo)水平[5]。苯溴馬隆具有潛在的肝臟毒性。丙磺舒可以與非甾體抗炎藥產(chǎn)生相互作用，臨床應(yīng)用受到限制[6]。因此，研究和開發(fā)既能有效降低患者血尿酸水平，又能延緩高尿酸血癥腎損害（hyperuricemic nephropathy，HN）發(fā)生發(fā)展的藥物，且不良反應(yīng)少的藥物是極具可行性且必要的一項(xiàng)研究。

白芍是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，近年來，科研人員將白芍作為保健食品進(jìn)行了開發(fā)，例如張春婷等對(duì)以白芍作為主要原料的保健食品桂芍舒逸口服液進(jìn)行了工藝優(yōu)選，建立了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[7]。白芍總苷（total glucosides of paeony，TGP）為白芍干燥根中得到的芍藥苷（paeoniflorin）、羥基芍藥苷（hydroxy-paeoniflorin）、芍藥花苷（paeonin）、芍藥內(nèi)酯苷（albiflorin）、苯甲酰芍藥苷（benzoylpaeoniflorin）等具有生理功效成分的混合物，具有消炎[8]、提高免疫功能[9]、保肝[10]、降脂[11]、降低空腹血糖[12]等作用。此外，TGP還可通過增加小鼠糞便含水量，提高腸動(dòng)力改善便秘癥狀；調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)受損腸道屏障功能恢復(fù)[13-14]。

在腎臟方面，TGP可抑制系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠血清中干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL6）和IL12的表達(dá)及dsDNA水平，同時(shí)減輕小鼠的腎損傷，抑制小鼠的自身免疫[15]。Lv[16]發(fā)現(xiàn)，馬錢子總生物堿具有腎臟毒性作用，使大鼠腎臟血尿素氮和肌酐水平明顯升高，腎小管上皮細(xì)胞渾濁腫脹、變性，腎小球萎縮，TGP可以減弱TAS的吸收，加速其清除，減輕上述損害。本研究制造了HN模型，通過每?jī)芍苎劭羧⊙姆绞剑瑒?dòng)態(tài)的觀察大鼠體重、血清中的尿酸、肌酐、尿素氮等生化指標(biāo)，然后對(duì)腎進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，考察和評(píng)價(jià)TGP對(duì)HN大鼠腎臟的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級(jí)雄性SD大鼠50只 體重220±10 g，6±1周齡，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（川）2020-030；每只大鼠分籠飼養(yǎng)于成都醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SYXK（川）2020-196，飼養(yǎng)環(huán)境為室溫22±2 ℃、濕度55%±5%、12 h光照～12 h黑暗交替。氧嗪酸鉀（批號(hào)：H2017151） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；腺嘌呤（批號(hào)：C11001521） 上海麥克林生化科技有限公司；白芍總苷膠囊（0.3 g/粒，每粒含芍藥苷不少于104 mg；批號(hào)：200512） 寧波立華制藥有限公司；別嘌醇片（批號(hào)：20020602） 萬全萬特制藥有限公司；肌酐試劑盒（批號(hào)：20201106）、尿素氮試劑盒（批號(hào)：2020-1105）、尿酸試劑盒（批號(hào)：202001104） 南京建成生物工程研究所；HE染色試劑盒（批號(hào)：20200829）、PAS染色試劑盒（批號(hào)：20201111）、中性樹膠（批號(hào)：330A023） 北京索萊寶科技有限公司。

Centrifuge 5415D小型臺(tái)式高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；CP225D精密分析天平 德國(guó)Sartorious公司；Varioskan Flash酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；BX63正置熒光顯微鏡顯微鏡 日本Olympus公司；Leica RM 2016超薄切片機(jī) 美國(guó)Feica公司；Specord 50 plus紫外分光光度計(jì) 德國(guó)耶拿分析儀器股份公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型的建立 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組、模型組、TGP低、高劑量組和陽性藥物組，每組10只。每天上午7:00和晚上20:00，除正常組外，其余各組分別灌胃制備HN模型（腺嘌呤100 mg/kg+氧嗪酸鉀1500 mg/kg，用0.5%羧甲基纖維素鈉將兩者混合后制成混懸液[17]）。每天中午12:00，TGP低劑量組灌胃給予TGP 100 mg·kg-1·bw-1，TGP高劑量組灌胃給予TGP 300 mg·kg-1·bw-1，陽性藥物組灌胃給予別嘌醇27.0 mg·kg-1·bw-1，正常組和模型組灌胃給予等量生理鹽水，每天給藥1次，持續(xù)5周。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)及處理

1.2.2.1 取樣及樣品處理 每2周稱重，然后用眼眶取血方法，每只取血1 mL，然后37 ℃水浴30 min，5000 r/min離心15 min，取血清200 μL。

1.2.2.2 腎重及腎體比的測(cè)定 最后1次取血后，頸椎脫臼處死大鼠，取左右腎，分別稱重，計(jì)算雙腎重量與體重之比（腎體比）。

1.2.2.3 血清中尿酸、肌酐和尿素氮的檢測(cè) 參照試劑盒說明書，采用紫外分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀測(cè)定大鼠血清中尿酸、肌酐和尿素氮的水平。

1.2.2.4 腎小球和腎小管的病理檢測(cè) 用生理鹽水清洗后，浸泡在10%中性甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片厚3 μm，PAS染色光鏡下觀察腎小球有無病理變化，HE染色光鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)無腎小球只有腎小管的視野，對(duì)腎小管間質(zhì)損傷和腎臟炎性細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)行半定量測(cè)定，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。利用BX63正置熒光顯微鏡拍照。

表1 腎小管間質(zhì)損傷和腎臟炎性細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[18]Table 1 Scoring criteria for tubulointerstitial injury and renal inflammatory cell infiltration[18]

1.3 數(shù)據(jù)處理

計(jì)量資料用 xˉ±s表示。應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05表示差異有顯著性；P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠的體重變化

結(jié)果見表2。與正常組相比，制造了HN模型的各組大鼠體重在第1、3、5周均極顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，在第3周時(shí)，TGP高劑量組和別嘌醇組的體重顯著升高（P＜0.05），但在第5周時(shí)，TGP高、低劑量組和別嘌醇組與模型組的體重均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明TGP并不能升高HN模型的體重。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)體重的變化（g）Table 2 Changes of body weight of rats in each group atdifferent time points (g)

2.2 TGP對(duì)HN大鼠雙腎重與體重的比值的影響

腺嘌呤是制備HN模型的主要藥物之一，腺嘌呤會(huì)增加小鼠相對(duì)腎重、血漿尿素和肌酐濃度，降低體重，引起腎臟DNA損傷[19]。由表3可見，與正常組相比，制造了HN模型的各組大鼠左、右腎重量和腎體比均極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，TGP高、低劑量組和別嘌醇組的左、右腎重量和腎體比均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），說明TGP高、低劑量和別嘌醇均能降低HN模型的腎重和腎體比。

表3 各組大鼠左腎、右腎重量及腎體比情況Table 3 Weight of left kidney, right kidney and ratio of kidney to body of rats in each group

2.3 TGP對(duì)HN大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中尿酸水平的影響

較高的尿酸水平會(huì)引發(fā)或者進(jìn)一步發(fā)展腎損傷，導(dǎo)致急性和慢性腎臟疾病的發(fā)生，所以在臨床上，患有高尿酸血癥的患者需要檢測(cè)腎臟功能以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)腎臟損傷[20-21]。由表4可見，與正常組相比，制造了HN模型的各組大鼠第1、3、5周血清中尿酸水平均極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，TGP低劑量組第1、3、5周血清中尿酸水平較模型組顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；TGP高劑量組和別嘌醇組第1、3、5周血清中尿酸水平較模型組均極顯著降低（P＜0.01），說明TGP高、低劑量和別嘌醇均能降低HN模型血清中的尿酸水平，但并不能降低至正常水平。

表4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中尿酸水平的變化（μmol/L）Table 4 Changes of serum uric acid level in rats of each group at different time points(μmol/L)

2.4 TGP對(duì)HN大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中尿素氮水平的影響

血清中的尿素氮是從腎小球?yàn)V過再排出體外，當(dāng)腎臟功能失代償時(shí)，血清中的尿素氮將升高，臨床通常將尿素氮作為判斷腎小球?yàn)V過功能的指標(biāo)[22]。由表5可見，與正常組相比，HN模型的各組大鼠第5周血清中尿素氮水平均極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，TGP低劑量組和別嘌醇組第1、3、5周血清中尿素氮水平較模型組顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；TGP高劑量組第3、5周血清中尿素氮水平較模型組顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），說明TGP高、低劑量和別嘌醇均能降低HN模型血清中的尿素氮水平，但并不能降低至正常水平。

表5 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中尿素氮水平的變化（mmol/L）Table 5 Changes of serum urea nitrogen level in rats of each group at different time points(mmol/L)

2.5 TGP對(duì)HN大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中肌酐水平的影響

血清中肌酐水平是反映腎臟功能的重要指標(biāo)，血清肌酐升高提示腎功能的損害[23]。急性腎損傷可導(dǎo)致短暫和持續(xù)的血清肌酐升高[24]。對(duì)于慢性腎臟病患者，血清肌酐是持續(xù)要監(jiān)測(cè)的指標(biāo)之一，血清肌酐含量越高，預(yù)后越差[25]。由表6可見，與正常組相比，制造了HN模型的各組大鼠第1、3、5周血清中肌酐水平均極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，TGP高劑量組和別嘌醇組第1、3、5周血清中肌酐水平較模型組顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；TGP低劑量組第3、5周血清中肌酐水平較模型組出現(xiàn)極顯著降低（P＜0.01），說明TGP高、低劑量和別嘌醇均能降低HN模型血清中的肌酐至正常水平。

表6 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中肌酐水平的變化（μmol/L）Table 6 Changes of serum creatinine level in rats of each group at different time points (μmol/L)

2.6 TGP對(duì)HN大鼠腎小球病理的影響

尿酸升高會(huì)造成腎小球損傷，高尿酸會(huì)導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞增殖，從而導(dǎo)致腎小球肥大和硬化[26-27]。由圖1可見，在400倍光鏡下可見，正常組腎小球結(jié)構(gòu)完整，管壁薄，管腔開放，腎小球系膜細(xì)胞未見明顯異常改變。模型組腎小球出現(xiàn)了中度系膜細(xì)胞增生，增生的系膜細(xì)胞呈團(tuán)塊狀聚集，部分毛細(xì)血管受擠壓。TGP低劑量組出現(xiàn)了輕度系膜細(xì)胞增生，TGP高劑量組和別嘌醇組未出現(xiàn)系膜細(xì)胞增生，說明TGP可緩解HN模型腎小球系膜細(xì)胞增生。

圖1 各組大鼠腎小球病理變化（PAS染色，400×，標(biāo)尺=20 μm）Fig.1 Pathological changes of glomeruli in rats of each group (PAS staining, 400×, Bar=20 μm)

2.7 TGP對(duì)HN大鼠腎小管病理的影響

高尿酸會(huì)通過促進(jìn)活性氧誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞凋亡，也可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化[28-30]。由圖2可見，在400倍光鏡下可見，正常組腎小管形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，腎小管間質(zhì)無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組有腎小管損傷，表現(xiàn)為腎小管擴(kuò)張，腎小管間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。由表7可見，TGP高、低劑量組和別嘌醇組可緩解腎小管擴(kuò)張，減少腎小管間質(zhì)損傷和腎臟炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（P均＜0.01）。

表7 各組大鼠腎小管間質(zhì)損傷和腎臟炎性細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分比較Table 7 Comparison of tubulointerstitial injury and renal inflammatory cell infiltration score in rats of each group

圖2 各組大鼠腎小管病理變化（HE，400×, 標(biāo)尺=20 μm）Fig.2 Pathological changes of renal tubules in each group (HE，400×, Bar =20 μm)

3 討論

近來的研究表明，TGP中的主要成分芍藥苷可明顯改善糖尿病腎病小鼠的臨床癥狀，通過抑制iNOS的表達(dá)以及TNF-α、IL-1β和MCP-1的產(chǎn)生而減少腎臟中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞數(shù)量而治療糖尿病腎病[31]。TGP可改善急性腎損傷大鼠血清中肌酐和尿素氮水平，增加腎細(xì)胞的活力，減輕腎臟細(xì)胞凋亡和抑制炎癥反應(yīng)[32]。由此可見，TGP對(duì)腎臟發(fā)揮著保護(hù)作用，但是目前的研究大多停留在研究TGP改善急性腎損害或者糖尿病所致的腎損害方面，對(duì)TGP改善高尿酸血癥所致的慢性腎損害的研究尚無相關(guān)報(bào)道。

本課題組研究發(fā)現(xiàn)，TGP能降低HN模型的腎重、腎體比，降低HN模型血清中的尿酸、尿素氮和肌酐水平，緩解HN模型腎小球系膜細(xì)胞增生，緩解腎小管擴(kuò)張，減少腎小管間質(zhì)損傷和腎臟炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，從而對(duì)HN大鼠的腎臟有一定的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)采用別嘌醇作為陽性對(duì)照藥物，研究結(jié)果表明TGP與別嘌醇具有相似的治療HN的作用，但TGP作為一種天然產(chǎn)物，服用安全，因此TGP在改善HN方面具有一定的應(yīng)用開發(fā)潛力。今后可更深層次的研究TGP對(duì)HN的相關(guān)基因表達(dá)水平的影響。