黑曲霉GOD基因在枯草芽孢桿菌中的表達

于思穎 程 鵬 張靜博 曹平華 李元曉 馬彥博 李 旺

河南科技大學動物科技學院，河南洛陽 471023

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）是一類含有黃素腺嘌呤二核苷酸（flavine adenine dinucleotide，FAD）的二聚體蛋白酶，能夠特異性催化β-D-葡萄糖被氧化成葡萄糖酸和過氧化氫[1]。GOD 基于其安全無毒等特性廣泛地應用于飼料添加劑、食品、制藥和化學等領域[2-7]。

枯草芽孢桿菌（B.subtilis）作為一種革蘭氏陽性菌，已被美國食品藥品監督管理局（FDA）評為生物安全（Generally regarded as safe，GRAS）菌株[8]，具有易于培養、繁殖速度快、遺傳背景清晰等特點。與大腸桿菌相比，其具有優異的蛋白分泌能力，方便下游表達產物的分離；同時，B.subtilis具有良好的發酵工藝技術，這為目的產物進一步擴大生產提供了基礎。B.subtilis表達系統已表達了多種產物并廣泛應用于制藥、食品和飼料等行業中[9-13]。

目前，大部分GOD 為野生菌或誘導菌生產，存在酶活力低且后續純化困難等問題，基因工程表達的GOD宿主多為畢赤酵母，由于畢赤酵母的表達往往需要甲醇誘導，難以直接應用于飼料和養殖生產。因此，本研究克隆了來源于黑曲霉的GOD 基因，以野生型動物益生菌為宿主，以期獲得高效表達GOD 的枯草芽孢桿菌，推動其在動物養殖中的應用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1）土樣：采自河南省洛陽市某葡萄園，采用多點混合法采集0～10 cm的土壤。

2）菌株、質粒和引物見表1。

表1 本試驗所用菌株、質粒和引物

3）主要試劑：鄰聯茴香胺、辣根過氧化物酶、真菌DNA提取試劑盒購自上海生工生物有限公司；Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker、蛋白質Marker 購自Takara 公司；T4DNA 連接酶、NotI、NdeI、HindⅢ限制性內切酶購自Sigama 公司；質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

4）培養基。

①平板分離培養基：葡萄糖80 g/L、蛋白胨3 g/L、硫酸銨0.4 g/L、磷酸二氫鉀0.19 g/L、硫酸鎂0.16 g/L、碳酸鈣3.5 g/L、可溶性淀粉10 g/L、碘化鉀1.7 g/L、脫氧膽酸鈉0.2 g/L、加入適量鏈霉素（100 μg/mL）、瓊脂粉15 g/L、磷酸緩沖液0.1 mol/L，pH為5.6。

②發酵培養基：葡萄糖80 g/L、蛋白胨3 g/L、磷酸二氫鉀2 g/L、硫酸鎂0.7 g/L、氯化鉀0.5 g/L、硝酸鈉0.4 g/L、碳酸鈣3.5 g/L，自然pH。

③PDA 培養基：馬鈴薯200 g（加水1 L，煮沸30 min，紗布過濾），葡萄糖20 g，補水至1 L，自然pH，配制固體培養基時加入瓊脂粉20 g/L。

④LB 培養基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L；pH 7.0，121 ℃下滅菌20 min，配置固體培養基時加入瓊脂粉20 g/L。抗性培養基中Amp的最終質量濃度是100 μg/mL。

1.2 試驗方法

1）菌株篩選。采用Fiedure.K.J 顯色法，稱取10 g 采集的土樣置于滅菌的裝有100 mL生理鹽水且帶有適量玻璃珠的250 mL錐形瓶中，28 ℃，160 r/min振蕩培養30 min。然后用無菌水稀釋上清液至10-3、10-4、10-53個稀釋度，分別用無菌槍頭吸取100 μL 涂布于預先配制且滅菌的平板分離培養基，28 ℃培養3 d 后置于4 ℃冰箱中靜置，觀察藍紫色顏色圈，選取較大顏色圈中的菌株接種于PDA 斜面培養基，28 ℃培養至長出成熟孢子，保存于4 ℃。將初篩得到的斜面培養的菌株接種于發酵培養基中，28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養5 d，取發酵上清液及菌體測酶活。

2）酶活力測定方法。

①葡萄糖氧化酶酶活的定義：在pH 5.6，溫度為30 ℃的條件下，每分鐘催化1 μmol葡萄糖轉化為葡萄糖酸和過氧化氫所需的葡萄糖氧化酶的量定義為1個酶活力單位（U）。

②底物體系：吸取1 mL 5%葡萄糖溶液，2 mL 0.07 g/L 鄰聯茴香胺溶液，0.1 mL 60 U/mg 辣根過氧化物酶溶液于同一試管中，30 ℃恒溫水浴10 min。

③酶活測定：吸取0.1 mL 稀釋10 倍后的粗酶液于底物中搖勻，于波長460 nm 處每1 min 記錄1次吸光度值（A460nm），共測定5 min，以A460nm對時間作圖，計算最大斜率ΔA（min），根據下式計算酶活（X）：

X=ΔA*f/（11.3*t*V1/V2）

式中：f為粗酶液稀釋倍數；11.3 為消光系數；t為感應時間，min；V1為粗酶液體積，mL；V2為反應液總體積，mL。

3）基因組DNA的提取與目的基因的克隆。

①菌體的預處理：采用PDA 培養基平板活化待測菌株，于28 ℃培養至長出褐色孢子，之后接種于PDA 液體培養基，30 ℃、180 r/min 振蕩培養2～3 d，過濾出菌體，-80 ℃凍存。

②基因組DNA 的提取與鑒定：取凍存的菌體，在液氮中研磨，稱取0.2 g 研磨后的菌體，參照真菌DNA 抽提試劑盒提取待測菌株的基因組DNA，-20 ℃保存備用。采用真菌通用引物ITS1與ITS4 對5.8S rDNA-ITS 區序列進行PCR 擴增（94 ℃3 min，94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃2 min，運行35 個循環，72 ℃終延伸10 min），PCR 反應產物送至北京六合華大基因公司測序。

③目的基因的克隆：根據NCBI GenBank 上已公布的黑曲霉GOD 基因序列（登錄號：MH593586.1），設計克隆GOD 基因所用的特異性引物F、R。以黑曲霉基因組DNA 為模板，F、R 為引物進行PCR 擴增（98 ℃10 s，55 ℃30 s，72 ℃2 min，運行30 個循環），PCR 產物經純化回收后得到GOD 基因片段，連接pGEM-T Easy 載體，并轉化E.coliDH5α，通過藍白斑篩選，挑取白斑單菌落經菌落PCR 鑒定獲得陽性克隆子，提取pGEM-T-GOD 質粒雙酶切驗證后送測序，保存測序正確的菌株。

4）重組表達質粒的構建。結合枯草芽孢桿菌密碼子偏好性，對黑曲霉GOD編碼序列進行密碼子優化，優化后的氨基酸序列及核酸序列如下，在N端加上了34 個氨基酸信號肽（綠色部分），C 端加上了His-tag（紅色部分）。在核酸序列兩端添加NdeI（黃色序列）和HindⅢ（灰色序列）酶切位點，核酸序列全長1 902 bp，編碼629 個氨基酸，蛋白分子量約68.44 ku，序列交由公司（南京金斯瑞）合成。

氨基酸序列：MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASAE-Protein-HHHHHH..

核酸序列 pGOD：CATATGTTTGCAAAACGATTCAAAACCTCTTTAC

TGCCGTTATTCGCTGGATTTTTATTGCTGTTTC ATTTGGTTCTGGCAGGACCGGCGGCTGCGAGTGCTGAA-DNAsequence-CACCACCATCATCATCATTAATGAAAGCTT

分別酶切目的片段GOD 和載體質粒pT7M，用膠回收試劑盒將片段GOD 的酶切產物和質粒pT7M的酶切產物回收純化。在T4 DNA 連接酶的作用下構建重組質粒pT7M-GOD，轉化E.coli DH5α，經Amp（氨芐青霉素）抗性平板篩選和雙酶切鑒定，同時送至華大基因公司測序驗證，保存測序正確的菌株。

5）枯草芽孢桿菌的轉化及誘導表達。將鑒定正確的重組質粒pT7M-GOD通過化學轉化的方式轉入枯草芽孢桿菌7024E感受態中，在37 ℃、200 r/min搖床復蘇培養60 min 后涂于含有12.5 μg/mL 四環素的LB瓊脂平板上，37 ℃培養過夜。選取3株長勢良好的單菌落，分別接種于含有12.5 μg/mL 四環素的4 mL LB 培養基中，分為3 組，37 ℃、200 r/min 振蕩培養至OD600值達0.6～0.8 時，第1 組作為陰性對照，不添加誘導劑；第2組加入終濃度為2%木糖誘導表達，25 ℃誘導培養16 h；第3 組加入終濃度為2%木糖誘導表達，37 ℃誘導培養4 h。

6）目的基因的表達。收集培養物上清與菌體沉淀，在沉淀中加入裂解液（50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，5%甘油，pH 8.0），用超聲波破碎儀破碎。分別取培養物上清，全細胞裂解液，破碎液上清與沉淀，加入5×loading buffer 混勻，煮沸10 min，通過SDSPAGE 檢測粗蛋白的表達情況，通過制備單克隆抗體，利用Westen-blot檢測目的基因的表達。

2 結果與分析

2.1 產酶菌株的篩選與鑒定

通過對采集的土樣進行初篩和復篩，得到4 株產胞內GOD 酶活較高的菌株，測得酶活力如表2所示，由表2可以看出，菌株P-1 產酶性能較好，發酵5 d 后發酵液中GOD 酶活為2.820 U/mL，選定菌株P-1為出發菌株進行后續研究。

表2 分離菌株產GOD酶活測定結果

分析菌株P-1 的生長及形態特征，與曲霉鑒定手冊中黑曲霉比較接近。利用真菌通用引物ITS1/ITS4，擴增菌株P-1 的ITS 區基因，PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳，結果與理論編碼序列大小相符，如圖1所示。將測序得到的菌株P-1 IST 區基因序列在NCBI 中進行BLAST 分析，并構建系統發育樹見圖2。由圖2可知，與GenBank 數據庫中曲霉菌相關菌株的ITS 區基因序列的5.8S rDNA-ITS 區序列比較分析，發現其與曲霉屬（Aspergillussp.）的黑曲霉菌（Aspergillus niger）親緣關系最近。綜合菌株的菌落形態、生長特性及5.8S rDNA-ITS 區序列系統進化分析，確定菌株P-1為黑曲霉。

圖1 菌株P-1的IST區基因PCR產物

圖2 菌株P-1的5.8S rDNA ITS區序列系統發育樹

2.2 目的基因的克隆與鑒定

以黑曲霉P-1基因組DNA為模板，利用引物F、R 進行PCR 擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖3A。質粒pGEM-T-GOD 經酶切，結果如圖3B。測序結果顯示，目的基因片段全長1 818 bp，編碼605 個氨基酸，將其序列與GenBank 中公布的GOD 基因序列進行比對，相似度為81%～99%，證明成功擴增了黑曲霉GOD基因，命名為pGOD。

圖3 pGOD基因的PCR 擴增（A）和pGEM-T-pGOD的酶切鑒定（B）

2.3 重組表達質粒的構建與鑒定

重組質粒pT7M-GOD 經雙酶切驗證，結果顯示GOD 基因已經插入到表達載體pT7M 中（圖4）。重組質粒的測序結果顯示，目的基因序列與優化后pGOD 的序列完全一致，重組表達載體pT7M-pGOD構建正確。

圖4 pT7M-GOD的雙酶切鑒定

2.4 目的基因的表達

將鑒定正確的重組質粒pT7M-pGOD 轉入枯草芽孢桿菌7024E 感受態中，經2%木糖誘導發酵培養后的SDS-PAGE 分析結果見圖5。結果顯示，1，2泳道和7，8泳道可見約68 ku大小的條帶，與理論上pGOD蛋白的分子質量大小一致。且2、8泳道明顯比1、7泳道的表達量高。結果表明，pGOD 基因能夠在枯草芽孢桿菌中表達，且在37 ℃培養4 h 表達量較高。

圖5 pGOD蛋白表達產物的SDS-PAGE

制備單克隆抗體，利用Westen-blot對表達的粗蛋白進行檢測，結果如圖6所示，在樣品3、4、5、6 中出現明顯的目的基因產物。大小與預期pGOD蛋白分子質量一致，說明該表達系統成功表達了pGOD基因，屬于胞內表達的可溶性蛋白。

圖6 表達產物Western-blot檢驗

3 討 論

GOD 作為一種新型的酶制劑，近年來在養殖行業應用廣泛，GOD 可以改善動物腸道環境，增強腸道有益菌群，降低霉菌毒素中毒損傷，提高內源酶活，提高飼料消化率。大量的文獻報道表明產GOD的菌種主要是曲霉屬（Aspergillus）和青霉屬（Penicillium）[14-16]，本研究從土壤樣品中篩選到產GOD 的微生物，經鑒定為黑曲霉，也驗證了這一結論，說明霉菌是產GOD的主要微生物菌種。

但天然菌株發酵生產GOD 的酶活性低，且純化工藝復雜。因此，構建高效表達GOD的重組菌株成為主要研究方向。近十幾年來，多種來源的GOD基因被克隆[17-18]，本研究所擴增的GOD 基因片段全長1 818 bp，編碼605 個氨基酸，將其序列與GenBank中公布的GOD 基因序列進行比對，相似度為81%～99%，部分位點的堿基出現差異，其主要原因是不同物種的編碼基因有差異。所克隆的GOD 基因在大腸桿菌（Escherichia coli）、里氏木霉（Trichoderma reesei）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和畢赤酵母（P. pastoris）等宿主中成功表達[19-22]，并且酶活性得到顯著提高。如陳楠等[23]利用具有AOX1 強啟動子的表達載體pPICZαA，在畢赤酵母SMD1168 中成功表達了黑曲霉PCTC GOD 基因，并對重組菌進行產酶條件優化，優化后酶活達32 U/mL，提高了27倍。然而在動物益生菌枯草芽孢桿菌中表達GOD基因的未見報道，B. subtilis屬于動物益生菌，發酵條件簡單，目前已有很多的研究報道使用B.subtilis作為高效生產的工程菌株[24-25]。加之為了更好地服務于養殖和飼料，本研究將GOD基因在野生型枯草芽孢桿菌中進行了表達，成功獲得了表達產物。但由于是異源表達，需對目的基因的密碼子進行優化[26-27]，通過密碼子優化構建表達載體pT7M-pGOD，使枯草芽孢桿菌成功地表達了來源于黑曲霉的GOD基因，為構建高效表達GOD的基因工程菌提供了新的思路。

4 結 論

從土壤樣品中篩選出1 株高產葡萄糖氧化酶（GOD）的黑曲霉菌株，將黑曲霉菌的GOD基因克隆到載體pT7M，重組質粒pT7M-pGOD 轉化到枯草芽孢桿菌中異源表達，獲得了產GOD的枯草芽孢桿菌工程菌株。