果糖對綿羊精液常溫保存效果的影響

盛 云 許 靜

1.江蘇省盱眙縣盱城街道綜合服務中心，江蘇盱眙 211700；2.江蘇省盱眙縣動物衛生監督所，江蘇盱眙 211700

在養羊生產中使用人工授精技術可以大大提高種公羊的利用效率，防止一些疾病的傳播、提高受胎率和減少一定的養殖成本等[1-3]。因為綿羊精液保存技術的缺乏，實際生產中大多采用新鮮精液進行輸精，受時間和區域的限制不能充分發揮人工授精技術的優勢。人工授精技術的核心是精液有效保存時間的延長，而影響精液保存時間的因素之一是稀釋液成分的選擇[4-5]。稀釋液是由營養物質、緩沖物質和抗菌物質組成，營養物質在其中的作用至關重要，糖類物質是最主要也最常使用的營養物質之一，精子可以利用稀釋液中的糖類營養物質為其運動和存活提供能量[6]。精液常溫保存過程需要消耗一定的糖類，因此，在稀釋液中必須添加適宜濃度的糖類，低濃度的糖不能滿足精液保存過程中的消耗，縮短精子的有效存活時間，而過高濃度的糖則會影響稀釋液的滲透壓，破壞精子的結構，從而影響精液的保存品質[7]。另一方面果糖在人精漿中含量較高，對精子具有一定的保護作用，但在精液體外保存中添加果糖的研究較少[8]。因此，為探究糖類添加量對綿羊精液常溫保存的影響，本研究在稀釋液中添加不同濃度的果糖，通過檢測精子活率、活力和直線速率等精子運動性能來確定稀釋液中最適宜的果糖添加量，以提高精液的保存品質、延長精子的存活時間，從而提高人工授精技術的受胎率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1）試驗動物：本試驗所用精液采自于江蘇綠森然有限公司提供的3 只健康湖羊，年齡為2 歲，膘情優良，體質健壯，無任何疾病。

2）主要儀器設備：邁朗全自動精子分析儀、恒溫水浴鍋、電子分析天平、渦旋振蕩器和恒溫箱。

3）主要試劑與藥品：三羥甲基氨基甲烷（Tris）、果糖、檸檬酸、青霉素鈉和硫酸鏈霉素。

1.2 試驗設計

本試驗采用含有0.005、0.010、0.020、0.040、0.080 g/mL 果糖的綿羊精液常溫保存稀釋液對綿羊精液進行15 ℃常溫保存，每隔24 h 輕輕翻動精液，防止精子沉淀聚積。在精液保存期間，每天采用CASA 對精子活率、活力、直線速率、曲線速率、路徑速率、移動角度和側擺幅度進行檢測，以評價不同濃度的果糖對綿羊精液常溫保存的作用效果。

1.3 試驗方法

1）稀釋液配置：使用電子天平準確稱取0.20、0.40、0.80、1.60、3.20 g 果糖，1.23 g Tris，0.66 g 檸檬酸，0.01 g 青霉素鈉和0.03 g 硫酸鏈霉素，分別充分溶解于40.00 mL 滅菌的超純水，配置成含有0.005、0.010、0.020、0.040、0.080 g/mL 果糖的綿羊精液常溫保存稀釋液。

2）精液采集與稀釋：采用假陰道法采集公羊精液，采精結束后，將精液置于37 ℃保溫杯并在30 min內帶回實驗室。對精液品質進行常規檢查，選取顏色、氣味和射精量正常的精液鏡檢，選取精子活力80%以上、畸形率低于15%的精液進行混勻處理，采用預熱的含有不同濃度果糖的稀釋液進行稀釋，然后用多層棉花包裹置于15 ℃恒溫箱保存。

1.4 數據統計分析

采用Excel 對試驗數據進行整理，利用SPSS 軟件對數據進行單因素方差分析，處理結果用“平均值±標準誤”表示。每組設置有3個重復，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 在常溫保存下不同質量濃度果糖對綿羊精子活率的影響

由表1可知，添加適宜濃度的果糖可以提高綿羊精液常溫保存的精子活率，但過高濃度的果糖會顯著降低精子活率。各組的精子活率隨果糖質量濃度的提高呈現先上升后下降的趨勢，且0.040 g/mL 果糖添加量的精子活率最高，0.080 g/mL 果糖添加量的精子活率顯著降低。保存1～3 d、5 d、7～8 d 時，0.040 g/mL 果糖添加量的精子活率顯著高于其他各組；保存4 d、6 d 時，0.020 g/mL 和0.040 g/mL 果糖添加量的精子活率顯著高于0.005 g/mL 和0.080 g/mL組，但0.020 g/mL和0.040 g/mL組間差異不顯著。

表1 在常溫保存下不同質量濃度果糖對綿羊精子活率的影響%

2.2 在常溫保存下不同質量濃度果糖對綿羊精子活力的影響

由表2可知，添加適宜濃度的果糖可以提高綿羊精液常溫保存中的精子活力，但添加過多的果糖會顯著降低精子活力。各組的精子活力隨果糖質量濃度的提高呈現先上升后下降的趨勢，且0.080 g/mL果糖添加量的精子活力顯著降低。保存1 d 時，0.020 g/mL 和0.040 g/mL 果糖添加量的精子活力顯著高于0.005 g/mL和0.080 g/mL組；保存2 d時，0.010、0.020和0.040 g/mL果糖添加量的精子活力均顯著高于0.005 g/mL和0.080 g/mL組；保存3 d時，0.020 g/mL和0.040 g/mL 組的精子活力顯著高于0.005 g/mL 和0.080 g/mL組；保存4 d時，0.020 g/mL和0.040 g/mL組的精子活力顯著高于其他各組；保存5～7 d時，0.040 g/mL組的精子活力顯著高于其他各組。

表2 在常溫保存下不同質量濃度果糖對綿羊精子活力的影響%

2.3 在常溫保存下不同濃度果糖對綿羊精子運動性能的影響

由表3可知，保存2 d 時，0.040 g/mL 果糖添加量的直線速率最高，但與其他各組差異不顯著；保存3 d 時，0.020 g/mL 果糖添加量的直線速率顯著高于0.005 g/mL 和0.080 g/mL 組，但與其他組差異不顯著；保存4～5 d 時，0.080 g/mL 果糖添加量的直線速率顯著低于其他各組；保存6 d 時，0.040 g/mL 果糖添加量的直線速率最高，且顯著高于0.010 g/mL、0.020 g/mL 和0.080 g/mL 組；保存7 d 時，0.040 g/mL果糖添加量的直線速率最高，且顯著高于0.005、0.010 和0.080 g/mL 組；保存8 d 時，0.040 g/mL 果糖添加量的直線速率最高，且顯著高于0.080 g/mL組，但與其他組間差異不顯著。

表3 在常溫保存下不同質量濃度果糖對綿羊精子運動性能的影響

續表

保存2 d、5 d 和8 d 時，0.080 g/mL 果糖添加量的精子曲線速率、路徑速率顯著低于其他各組；保存3 d 時，0.020 g/mL 和0.040 g/mL 果糖添加量的曲線速率、側擺幅度顯著高于其他各組，但0.020 g/mL 與0.040 g/mL 組間差異不顯著；保存4 d時，0.020 g/mL 和0.040 g/mL 果糖添加量的曲線速率、路徑速率、側擺幅度顯著高于0.080 g/mL 組；保存6～7 d 時，0.040 g/mL 果糖添加量的曲線速率、路徑速率、側擺幅度最高，且顯著高于其他各組。保存2 d 時，0.040 g/mL 果糖添加量的路徑速率、側擺幅度最高，且顯著高于0.080 g/mL 組；保存3 d 時，0.020 g/mL 和0.040 g/mL 果糖添加量的路徑速率顯著高于其他各組；保存5 d時0.080 g/mL果糖添加量的路徑速率、側擺幅度顯著低于其他各組。保存1～4 d、6～7 d 時，0.040 g/mL 果糖添加量的移動角度最高，且顯著高于0.080 g/mL 組；保存5 d 時，0.040 g/mL果糖添加量的移動角度顯著高于其他各組。

3 討 論

由于綿羊精子結構的特殊性，導致其對超低溫冷凍的不耐受，容易造成精子結構的損傷，在解凍后精子活率低、人工授精后受胎率低下，現階段的綿羊凍精技術不夠成熟；另一方面由于綿羊凍精技術操作的復雜性以及高昂設備費，目前在生產實踐中的使用價值不大[9]。鮮精、常溫和低溫保存的精液具有精子活力高、精子密度大、成本低、操作簡單和對精子的損傷較小等優點，但是其保存時間較短，精子有效存活時間不能滿足生產實踐需要。精子活力代表著精子直線前進運動的能力，與精子受精能力關系密切，是反映精子功能和評價精液質量的重要指標，是精子穿過生殖道、與卵母細胞成功結合的前提[10-11]。

糖類物質是精液稀釋液中的重要組成成分，在稀釋液中有重要的作用。首先，糖類物質可以作為營養物質為精子的生存、運動和代謝提供能量；糖類物質還可以提高過氧化物酶的活性，防止細胞膜的脂質過氧化，保持細胞膜通透性的穩定。其次，糖類物質可以調節精子的滲透壓，防止滲透壓改變對精子膜結構產生的損傷，可以保持精子的活力、受精能力和膜結構的完整；精子膜結構對于其獲能、頂體反應、穿過透明帶和維持自身代謝等非常重要，完整的頂體對頂體反應的發生至關重要，若頂體受到損傷，受精過程就不能完成。最后，在超低溫冷凍保存中，糖類物質還可以作為非滲透性保護劑，不能進入精子細胞內部，在特定溫度下可以降低溶質濃度，提高胞外的滲透壓，避免胞內水分外流而使細胞皺縮，且糖類物質具有一定的黏性，吸附在精子細胞的外圍，可以減少胞內冰晶的形成，在一定程度上避免精子膜結構產生損傷，提高解凍后的精子活率和頂體完整性[12-15]。

李新紅等[16]在對藍狐精子的研究中發現，稀釋液中糖類物質的添加與否對精液短期保存的質膜完整率和頂體完整率有顯著影響；毛冉等[17]在杜泊羊精子的研究中發現，有糖類物質添加時，各項指標如精子平均活率、存活時間、質膜完整率和頂體完整率均顯著高于沒有糖類物質添加組；有較多的研究表明，果糖和葡萄糖是精子的主要能量來源，且添加果糖時的犬精子解凍后的精子活率高于添加葡萄糖時的精子活率；葉小萍等[18]在人精子的研究中發現，精漿果糖含量與精子活動力有顯著的相關性，精漿果糖含量越高，精子活動力越強；邱建華[19]在山羊精液的研究中發現，無論是否使用卵黃包被，適宜濃度的葡萄糖可以提高精子活率，過高濃度的葡萄糖則會影響精子活率；劉鑫[20]在豬精子的研究中發現，添加中間適宜濃度的果糖可以顯著提高精子活率和質膜完整率。本試驗研究發現，精液的保存品質并非與稀釋液中營養物質的添加量成正比，在綿羊精液常溫保存稀釋液中添加適宜濃度的果糖可以提高精液常溫保存品質，過高濃度的果糖則會降低精子活率、活力，縮短精子保存時間，與上述研究結果相一致。這可能是由于過高濃度的果糖會影響精液稀釋液的滲透壓等理化性質，另一方面還可能是過量的葡萄糖使精子產生過多的代謝廢物，使精子酸中毒死亡[21]。本試驗中適宜濃度果糖提高精子活力的原因可能是糖分子的羥基跟脂質雙分子層的頭端極性基團磷脂結合成穩定的氫鍵，進而穩定質膜[22-23]。

4 結 論

在綿羊精液常溫保存中添加適宜濃度的果糖可以改善精液保存品質，提高精子存活時間，最適宜的果糖添加濃度是0.040 g/mL。