lncRNA-H19通過靶向miR-106a-5p在骨關節炎軟骨基質降解和鈣化中的調控作用

劉旭劍，王東來，李增懷，馮奇，常富軍，馮建剛

(1.河北醫科大學第四醫院骨科，河北 石家莊 050011；2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第980醫院骨科，河北 石家莊 050000)

骨關節炎(osteoarthritis,OA)是一種慢性退行性關節疾病，其發病機制涉及機體的各種生理和病理過程[1]，但其確切發病機制尚不清楚。研究[2-4]指出，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和microRNA(miRNA)的表觀遺傳修飾對OA的發生及發展中發揮著重要作用，如軟骨組織中的miR-16/SMAD7軸可通過下調lncRNA MEG3的表達水平加速OA的進展[4]，且還可通過上調miR-146a和miR-98促進OA的進展[3]。此外，攜帶miR-140-5p的外泌體可促進OA大鼠軟骨細胞的增殖和遷移，而不擾亂細胞外基質的分泌[5]。lncRNA-H19具有調節細胞增殖、分化和代謝等生物學功能，可能是刺激軟骨恢復的潛在靶點，在膠質瘤細胞中可通過miR-138/HIF-1α軸上調lncRNA H19而促進細胞增殖、遷移[6]；lncRNA H19可通過對TNFAIP8的正向調節，改變EMT的級聯反應，促進乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[7]；lncRNA-H19在OA軟骨組織中的高水平表達可調控miR-675，進而影響軟骨的合成和分解代謝[8]。OA患者的miR-106a-5p表達下降，而增加miR-106a-5p的表達可改善前交叉韌帶橫斷(anterior cruciate ligament transaction，ACLT)所致OA模型的組織學體征[9]。本研究擬探討lncRNA-H19靶向miR-106a-5p在調節OA軟骨基質降解和鈣化中調控作用，旨在為OA軟骨細胞變性的診斷和治療提供潛在的靶點。

1 資料與方法

1.1 試劑與耗材

TRIzol試劑盒購置美國Invitrogen公司，PrimeScript TM RT Master Mix和LipofecamineTM2000試劑盒購置Eurofins MWG Operon公司(德國)，HC-A人軟骨細胞系購置上海奧路生物技術有限公司，Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)/F12培養基購于德國Biochrom AG Seromed公司，SYBR qPCR Mix和細胞計數試劑盒8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)(購置日本TaKaRa公司)，磷酸酶檢測試劑盒購置中國建成生物工程公司，BCA試劑盒購置美國賽默飛世爾科技公司，聚偏氟乙烯(PVDF)膜購置美國Millipore公司。Bax抗體、Bcl-2抗體、MMP-1抗體、MMP-13抗體、II型膠原α1(COL2A1)抗體、GAPDH及相關二抗均購置美國Abcam公司。

1.2 一般資料

采集2014年3月至2020年3月在河北醫科大學第四醫院接受關節置換術的30例原發性膝關節骨關節炎患者的軟骨組織樣本作為病例組。納入標準：(1)均符合原發性膝關節骨關節炎診斷標準[10]；(2)均行膝關節鏡手術治療；(3)發病于膝關節；(4)體重指數18～24 kg/m2。排除標準：(1)合并類風濕性關節炎者；(2)嚴重高血壓、高顱壓、Ⅱ型呼吸衰竭者；(3)心功能不全、心動過緩或嚴重的心律失常者；(4)嚴重的電解質紊亂者；(5)合并糖尿病、惡性腫瘤者；(6)局部感染、凝血功能異常者。另選同期30例截肢患者的關節軟骨組織樣本作為健康對照組。本次研究均經醫院倫理委員會批準，患者知情并同意。30例原發性膝關節骨關節炎患者中，男性17例，女性13例，平均年齡50.63歲(39～72歲)。30例截肢患者中，男性19例，女11例，平均年齡48.85歲(29～73歲)。兩組年齡、性別等資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

1.3 實時定量聚合酶鏈式反應(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RT-qPCR)

采用TRIzol試劑盒從臨床骨關節炎軟骨組織、健康軟骨組織和軟骨細胞中提取完整的RNA，先預冷磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)清洗2～3遍，加入1 mL Trizol裂解細胞15 min,待貼壁細胞完全脫落后，移至2 mL EP管，并使用紫外分光光度計測量RNA濃度。按照PrimeScript TM RT Master Mix試劑盒的說明書，在40 ℃反應6 min,65 ℃反應25 min，35個循環條件下合成互補DNA(complementary DNA，cDNA)，得到cDNA產物，保存于-80 ℃，用于進一步的qPCR實驗。RT-qPCR反應體系總量為20 μL，其中cDNA產物2 μL,50×ROX 0.4 μL,SYBR qPCR Mix 10 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL,RNase水添加至20 μL。U6作為miR-106a-5p的內參，β-actin作為mRNA表達的內參，每個實驗設3個重復，每個樣本重復3次。采用2-ΔΔCt法計算表達水平。所用引物及片段大小如下:lncRNA-H19 (650bp):F:5′-ATC GGT GCC TCA GCG TTC GG-3′,R:5′-CTG TCC TCG CCG TCA CAC CG-3′；ALP (454 bp):F：5′-CCC TTC ACT GCC ATC CTG TAC-3′,R:5′-CCA TGG AGA CGT TCT CTC TCT CA-3′；OCN (294 bp)：F:5′-GGC AGG GAA GTC AGG GTA G-3′,R:5′-CCC GTG GTT TCC TGG TC-3′；BSP (450 bp):F:5′-ATG CCT GCC TTG TAC CAC GAG C-3′,R:5′-TCC ATC GAA GAA TCA AAG CAG AG-3′；miR-106a-5p (23bp):F:5′-AAA AGU GCU UAC AGU GCA GGU AG-3′,R:5′-AAC CAT GAC CTC AAG AAC-3′；U6 (75bp):F:5′-CGC AAG GAT GAC ACG CAA ATT CG-3′,R:5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′；β-actin (325 bp)：F:5′-ATC ACT GCC ACC CAG AAG AC-3′,F:5′-TTT CTA GAC GGC AGG TCA GG-3′。

1.4 細胞培養和轉染

HC-A細胞在含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基中于37 ℃、5% CO2的潮濕無菌培養箱中培養，每兩天更換一次培養基。將細胞接種到6孔的培養皿中。24 h后，當細胞密度達到70%時，將細胞分為H19干擾組(si-H19,5’-TTC ATG TTG TGG GTT CTG GGA GCC-3’)、陰性轉染組(si-Control,5’-TGA TGT CTA GCG CTT GGG CTT TG-3’)、miR-106a-5p mimic組(miR-106a-5p,5′-AAA AGU GCU UAC AGU GCA GGU AG-3′)、mimic陰性對照組(miR-106a-5p-NC,5′-CAG UAC UUU UGU GUA GUA CAA-3′)、miR-106a-5p抑制劑組(inhibitor,5′-CUA CCU GCA CUG UAA GCA CUU UU-3′)和陰性抑制劑對照組(inhibitor-NC,5′-CAG GAC AGC UUC GAG UUA ATT-3′)組，所有序列均有生工生物工程(上海)股份有限公司合成。將最終濃度100 nmol/L的LipofecamineTM2000 si-H19、si-Control、miR-106a-5p mimic、miR-106a-5p-NC、inhibitor、inhibitor-NC、inhibitor+si-H19、inhibitor-NC+si-H19轉染細胞并孵化6 h，然后轉入完全培養基培養24 h。

1.5 細胞增殖實驗

轉染si-H19或si-Control后，收集細胞，以每孔1 000個細胞的密度接種到96孔板中，分別培養0、24、48或72 h。每孔加入終濃度為10%的CCK-8試劑盒溶液，避光孵育1 h。最后，采用全自動酶標儀ALISEI(意大利SEAC公司生產)在450 nm波長下檢測吸光度(optical density，OD)值，以表示細胞增殖情況。

1.6 細胞凋亡實驗

si-H19和si-Control轉染后，收集對數生長期的細胞并消化，然后用冷PBS洗滌兩次，用1 mL聯合緩沖液重懸使細胞密度為1×106/mL。將100 μL的細胞懸浮液加入5 mL的流管中，加入10 μL的Annexin-V-FITC和10 μL的碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色。隨后，在室溫下避光孵育15 min。使用BD FACS流式細胞儀(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)分析細胞凋亡率。所有測定均在3個獨立實驗中進行。

1.7 Western blot分析

提取轉染細胞的總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。變性后，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離總蛋白，并轉移到PVDF膜上。在5%脫脂牛奶中封閉后，將膜與Bax、Bcl-2、MMP-1、MMP-13、COL2A1和GAPDH一抗在4 ℃下孵育過夜。然后用含Tween 20的Tris緩沖鹽水(150 mM NaCl tris buffered saline Tween，TBST)洗滌膜，與二抗在室溫下孵育2 h，用TBST洗滌。最后，用增強化學發光(ECL)檢測試劑反應后，檢測蛋白條帶。使用Image J軟件對條帶的灰度值進行分析，首先，將所有條帶扣除背景影響；然后用目標蛋白的灰度值除以其對應泳道的內參照條帶灰度值，以此作為該組的目標蛋白相對表達量，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內參。

1.8 基質金屬蛋白酶活性檢測

提取細胞裂解液，根據制造商的說明，實驗嚴格按照pro-MMP-1和MMP-13 ELISA試劑盒說明書進行，采用酶聯儀在450 nm波長出依序測量各孔的OD值，在加終止液后15 min以內進行檢測。試劑盒的靈敏度分別為0.02 ng/mL和0.009 ng/mL。

1.9 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)測定

采用ALP檢測試劑盒法檢測ALP活性。每個轉染組的細胞用PBS洗滌，用含20 mM Tris-HCl(pH 8.0)、150 mM NaCl、1% Triton X-100、0.02% NaN3和1 Triton抑肽酶的溶液裂解。用移液管取相同體積的裂解液，37 ℃孵育15 min，采用分光光度計測定ALP活性。

1.10 統計學分析

2 結果

2.1 lncRNA-H19和miR-106a-5p在OA中的表達情況

與健康組織中lncRNA-H19 mRNA相比，OA軟骨組織中lncRNA-H19 mRNA的表達明顯升高，差異有統計學意義(t=43.225,P<0.05)；而與健康組織中miR-106a-5p mRNA相比，OA軟骨組織中miR-106a-5p mRNA的表達明顯降低(t=74.447，P<0.05)。見圖1。

2.2 lncRNA-H19對細胞增殖、凋亡的影響

si-H19轉染后，可顯著抑制lncRNA-H19 mRNA的表達(P<0.05)，并且可顯著促進細胞增殖，且至少維持72 h(P<0.05)。流式細胞儀檢測結果顯示，轉染si-H19沉默lncRNA-H19可以顯著抑制細胞凋亡(P<0.05)。而si-H19在HC-A細胞中可導致Bax低表達，Bcl-2高表達，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 lncRNA-H19對細胞外基質相關基因的影響

si-H19轉染HC-A細胞后，MMP-1和MMP-13的表達被抑制，COL2A1的表達增加，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

2.4 lncRNA-H19對軟骨細胞骨化相關指標的影響

轉染si-H19后，ALP、OCN和BSP mRNA水平顯著下調(P<0.05)。轉染si-H19也能抑制軟骨細胞的ALP活性，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

2.5 miR-106a-5p受lncRNA-H19負調控作用

轉染si-H19可顯著上調miR-106a-5p mRNA的表達水平(P<0.05)。轉染miR-106a-5p mimic可上調miR-106a-5p mRNA的表達，轉染miR-106a-5p inhibitor可抑制miR-106a-5p mRNA的表達。見圖5。

2.6 lncRNA-H19/miR-106a-5p對細胞外基質相關基因的影響

轉染miR-106a-5p inhibitor和si-H19后，與si-H19組相比，miR-106a-5p inhibitor組MMP-1和MMP-13表達水平和活性均上調，COL2A1表達水平下調，差異均有統計學意義(P<0.05)。此外，與si-H19+inhibitor-NC組相比，si-H19+miR-106a-5p inhibitor組MMP-1和MMP-13表達水平和活性均上調，而COL2A1表達下調，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖6。

2.7 lncRNA-H19/miR-106a-5p對軟骨細胞骨化相關指標的影響

轉染miR-106a-5p inhibitor和si-H19后，與si-H19組相比，miR-106a-5p inhibitor+si-H19組ALP、OCN、BSP mRNA水平均上調(P<0.05)，軟骨細胞ALP活性明顯增加(P<0.05)。與si-H19+inhibitor-NC組相比，miR-106a-5p inhibitor+si-H19組的ALP、OCN、BSP mRNA水平顯著上調(P<0.05)，軟骨細胞ALP活性明顯增加，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖7。

3 討論

OA以軟骨結構和功能退化為主要特征，病變部位多為關節周圍組織，最終可能導致關節疼痛和功能活動受限，是老年人常見的關節退行性疾病[11]。然而，關于OA的治療效果和預后并不理想。常用的非甾體抗炎和鎮痛藥只能通過減輕疼痛和炎癥來提高患者生活質量，關節內注射激素或透明質酸也只適用于緩解OA炎癥癥狀[12-13]。因此，對OA發病機制的深入研究可以為該病的治療提供詳細的理論依據。本研究結果表明，OA軟骨組織中lncRNA-H19表達上調，而沉默lncRNA-H19可明顯抑制軟骨細胞凋亡，促進軟骨細胞增殖，并下調MMP-1和MMP-13的表達水平，上調COL2A1的表達。沉默lncRNA-H19可抑制軟骨細胞ALP、OCN、BSP mRNA水平和ALP活性。另外，OA軟骨組織中miR-106a-5p表達下調，沉默miR-106a-5p顯著逆轉了沉默H19對軟骨細胞基質降解和鈣化標志物的抑制作用。提示lncRNA-H19高表達可能通過調節軟骨細胞增殖、凋亡、基質降解和鈣化過程參與OA的發展，同時與miR-106a-5p低表達密切相關。此外，miR-106a-5p的負調控被證明是lncRNA-H19調控OA軟骨基質降解和鈣化的重要機制之一。

MMP蛋白酶家族在骨性關節炎的病理過程中起著重要作用，廣泛分布于人體，其主要功能是控制細胞外基質成分的降解，是生理重建和病理損傷過程的主要因素之一[14-15]。在OA中，MMP在軟骨細胞、滑膜細胞和破骨細胞中表達，密切參與軟骨基質大分子的水解，包括II型膠原和多糖，最終破壞關節軟骨細胞外基質的結構和功能的完整性。MMPs是OA關節軟骨破壞的重要因素，骨關節炎患者滑膜液和軟骨中MMPs的濃度升高，與骨關節炎的嚴重程度呈正相關[16]。MMP-1是軟骨基質降解的限速酶之一，也是最典型的II型膠原，可降解膠原纖維三螺旋區的膠原，并誘導其他MMP家族成員的激活。MMP-13，在結締組織中表達，而在健康軟骨組織中很少表達或不表達，只有在軟骨成骨的過程中，MMP-13的分泌才能降解軟骨基質，達到成骨的目的。此外，MMP-13是一種強效蛋白酶，對細胞外基質中的膠原和非膠原物質具有特殊的降解作用，尤其是對II型膠原[17]。因此，MMP-13是裂解U型膠原最有效的蛋白酶。近期研究[18]證實，MMP-13不僅在受損軟骨中過表達，而且在滑膜組織、鈣化軟骨中表達上調。本研究發現，沉默lncRNA-H19可明顯下調MMP-1和MMP-13的表達水平，而過表達miR-106a-5p同樣可下調軟骨細胞中MMP-1和MMP-13的表達，提示lncRNA-H19和miR-106a-5p可能通過調節細胞外基質參與OA的發生發展。

此外，本研究還發現lncRNA-H19沉默顯著抑制了軟骨細胞中OCN、BSP的表達水平，并抑制了ALP活性，與Zhou等[19]研究相符。本文進一步研究發現，抑制miR-106a-5p可以部分逆轉lncRNA-H19沉默導致的ALP活性、OCN、BSP表達水平的下調，提示抑制miR-106a-5p的表達可促進細胞成骨分化與先前的研究[9,20]基本一致綜上所述，lncRNA-H19在OA軟骨組織中表達上調，lncRNA-H19可能通過抑制miR-106a-5p的表達，促進細胞外軟骨基質的降解和鈣化，從而參與OA的發生發展。