有氧運動對APOE-/-小鼠脂肪組織脂代謝的影響

王軍力，燕小妮

(懷化學院體育與健康學院，湖南 懷化 418000)

脂肪分布不同，產生心血管疾病的危險因子也不同[1]。與皮下脂肪組織 (Subcutaneous adipose tissue,SAT)相比，內臟脂肪組織(Visceral adipose tissue,VAT)更易引起各種代謝性疾病[2]。基因陣列研究也發現，肥胖人群VAT和SAT基因表達不同，與SAT相比，VAT產生了更多與心血管疾病和代謝紊亂有關的因素[3]。心外膜脂肪組織(Epicardial adipose tissue,EAT)胚胎學起源于VAT[4]，其厚度與VAT的厚度密切相關[5]，可能在與肥胖相關的心血管疾病的發生和發展中扮演著與VAT相似或者相同的作用。Thomas等研究表明有氧運動對VAT的體積的減少不依賴于SAT體積的減少[6]，而Kim等研究發現有氧運動對EAT厚度的降低伴隨著VAT厚度的減少[7]。這些研究表明在組織水平上，VAT與EAT對有氧運動具有相似的生物學適應，而SAT對有氧運動具有不同的生物學適應。但是關于VAT、EAT在蛋白水平對有氧運動是否也存在相似的生物學適應，以及與SAT是否不同的問題，目前尚缺少充分的實驗依據。

APOE-/-小鼠能對富含膽固醇的脂蛋白清除障礙，食用普通飼料即可自發形成動脈粥樣硬化病變[8]，且與人類動脈粥樣硬化的特征非常相似，因此成為研究動脈粥樣硬化的有效模型。高血壓、糖尿病、血脂異常以及全身炎癥等都是加速動脈粥樣硬化形成的機制[9]，而脂肪組織中過多的脂肪積聚會導致氧化應激水平提高，隨后造成脂肪因子異常分泌，這被認為是對血管壁產生不利影響。造成動脈粥樣硬化最為重要的機制[10，11]。目前，已有大量研究證實有氧運動是改善動脈粥樣硬化的有效方法，但這些研究主要集中在有氧運動對血管內皮功能、內皮源性細胞動員、血管及血清的炎性和氧化應激、血漿脂質的影響研究上[12]。目前還尚未有研究從有氧運動對動脈粥樣硬化病變的人或動物不同脂肪組織的脂代謝、氧化應激和炎性三種生理狀態關系層面，探討有氧運動對動脈粥樣硬化的有益影響。

因此，本研究試圖通過調查12wk有氧運動干預對SAT、VAT和EAT三種脂肪組織中與脂代謝[脂肪酸結合蛋白4(Fatty acid binding protein-4，FABP4)和脂滴包被蛋白(perilipin)]、氧化應激[谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxi dase，GSH-Px)、銅鋅超氧化物歧化酶(Copper/Zinc- superoxide dismutase，Cu/Zn-SOD)和錳超氧化物歧化酶(Manganese superoxide dismutase，Mn-SOD)]和炎性[脂聯素(adiponectin)、血管內皮生長因子ɑ(Vascular endothelial growth factor-ɑ，VEGFɑ)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-ɑ，TNF-ɑ)和白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)]相關的9種代表性蛋白表達的情況，一是觀察有氧運動對APOE-/-小鼠不同脂肪組織脂代謝、氧化應激和炎性狀態的影響，二是從蛋白水平探索APOE-/-小鼠不同脂肪組織三類蛋白對有氧運動的適應性特征，并從脂代謝、氧化應激和炎性三種生理狀態的關系層面，探討有氧運動對動脈粥樣硬化的有益影響。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物及分組

7周齡SPF級雄性APOE-/-小鼠，購自廣東省醫學實驗動物中心，許可證號為SCXK(粵)2008-0002，經過一周適應性的喂養后[動物房溫度為(25±1)℃，濕度為50%±5%，光照周期為12h]，隨機分為安靜組(AC組)和運動組(AE組)，每組各8只動物。APOE-/-小鼠喂養高脂飼料，高脂飼料配方為0.15 %(質量比)的膽固醇、21%(質量比)的脂肪和78.85%(質量比)的基礎飼料。

1.2 運動方案

APOE-/-小鼠采用不負重的游泳訓練模式，該模式在白色的大水桶中進行(無水流)，每桶4只動物，水深60 cm，水溫32±1℃。APOE-/-小鼠進行12wk的有氧運動，第1wk30min/d，第2-12wk 60 min/d，每周訓練6 d，第7 d休息。每天游泳訓練安排在下午5點至6點。

1.3 實驗取材

干預停止36 h后(避免急性運動效應)，利用10 %水合氯醛(3.5 ml/kg bw)對小鼠進行麻醉后，分別取腹部皮下脂肪組織(SAT)、腎周脂肪組織(VAT)和心外膜脂肪組織(EAT)置于液氮罐中備用。

1.4 主要實驗儀器、試劑及材料

1.4.1 主要實驗儀器

Ultra Pure UF純水系統(上海和泰儀器有限公司)；YXQ-LS-30SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)；WO-9413B型凝膠成像系統(北京六一儀器廠)；DYCZ-24DN型電泳儀(北京六一儀器廠)；DYCZ-40D型電泳儀(轉膜，北京六一儀器廠)；AX-ⅡX射線攝影暗(廣東粵華醫療器械廠有限公司)。

1.4.2 主要實驗試劑及材料

PVDF膜(Milli pore)；GADPH酶標記二抗 (武漢博士德)；兔抗大鼠FABP4(北京博奧森)、perilipin(北京博奧森)、GSH-Px(武漢博士德)、Cu/Zn-SOD(武漢博士德)、Mn-SOD(武漢博士德)、adiponectin(北京博奧森)、VEGFα (武漢博士德)、IL-6 (武漢博士德)和TNF-α (武漢博士德)多克隆抗體。

1.5 檢測指標及方法

脂肪組織FABP4、perilipin 、GSH-Px、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、adiponectin、VEGFα、TNF-α和IL-6蛋白表達均采用Western-blot方法檢測。Western-blot檢測步驟為：(1)取20 μL的組織裂解液，并加5 μL 5×電泳上樣緩沖液(預染Maker取5 μL)；(2)沸水浴5 min，12 000 g/min離心3 min，去除不溶性蛋白，上樣(BCA法總蛋白定量，上樣量為100 μg總蛋白/個樣品)；(3)SDS-PAGE電泳(5 %濃縮膠90V，12 %分離膠110 V，不恒定電流，約1.5 h)；(4)取分離膠將其放入電轉膜儀轉膜(90 V，30-90 min)，將蛋白轉移到PVDF膜上，室溫下用5 %脫脂奶粉(用TBS稀釋)室溫封閉30 min，再4 ℃過夜，第二天室溫平衡。不洗膜加一抗(1∶200，稀釋液含2 %的脫脂奶粉)孵育，4 ℃過夜。TBS洗膜四次，第一次15 min，后三次每次5 min。將膜在室溫下與二抗(1∶5 000，稀釋液含2 %的脫脂奶粉)室溫下孵育1 h，TBS漂洗；(5)將PVDF膜上的TBS吸干，加入ECL化學發光試劑(試劑盒)，放入凝膠成像系統;(6)采用WO-9413B型凝膠成像系統自帶軟件Gelpro32來分析膠片中的蛋白條帶中的灰度值。

1.6 數據統計

應用SPSS17.0對各組數據進行分析，描述性統計采用平均數±標準差(QUOTE±s)表示，不同組別數據的差異性采用單因素方差分析，p<0.05為顯著性差異，p<0.01為非常顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 不同組別APOE-/-小鼠脂肪組織脂代謝相關蛋白表達的分析

AC組APOE-/-小鼠VAT、EAT的FABP4的表達明顯低于SAT的FABP4的表達(P<0.05)，12wk有氧運動明顯增加了VAT、EAT的FABP4表達(P<0.01)，SAT的FABP4表達無明顯變化(P>0.05)(見圖1)；AC組APOE-/-小鼠VAT、EAT的perilipin的表達明顯高于SAT的perilipin的表達(P<0.05,P<0.01)，12wk有氧運動明顯降低了APOE-/-小鼠VAT的perilipin表達(P<0.01)，EAT的perilipin表達有降低的趨勢，但無統計學意義(P>0.05)，對SAT的perilipin表達沒有明顯影響(P>0.05)(見圖2)。*表示P<0.05，**表示P<0.01，與AC組SAT相應蛋白比較；#表示P<0.05，##表示P<0.01，與AC組同一脂肪組織相應蛋白比較(下同)。

圖1 不同組別FABP4表達變化(n=8)

圖2 不同組別perilipin表達變化(n=8)

2.2 不同組別APOE-/-小鼠脂肪組織氧化應激相關蛋白表達的分析

AC組APOE-/-小鼠VAT、EAT的GSH-Px表達明顯低于SAT的GSH-Px的表達(P<0.01)，SAT、VAT和EAT的Cu/Zn-SOD和Mn-SOD蛋白表達無明顯不同(P>0.05)(見圖3、圖4和圖5)；12wk有氧運動明顯增加了APOE-/-小鼠VAT、EAT的GSH-Px的表達水平(P<0.01)，對SAT的GSH-Px表達沒有明顯影響(P>0.05)(見圖3)；12wk有氧運動對APOE-/-小鼠三種脂肪組織的Cu/Zn-SOD表達沒有明顯影響(P>0.05)(見圖4)；12wk有氧運動明顯增加了APOE-/-小鼠VAT、EAT的Mn-SOD表達(P<0.05)，對SAT的Mn-SOD表達沒有明顯影響(P>0.05)(見圖5)。

圖3 不同組別小鼠GSH-Px表達變化(n=8)

圖4 不同組別Cu/Zn-SOD表達變化(n=8)

圖5 不同組別Mn-SOD表達變化(n=8)

2.3 不同組別APOE-/-小鼠脂肪組織炎性相關蛋白表達的分析

AC組APOE-/-小鼠VAT、EAT的VEGFα、TNF-α和IL-6的表達都明顯高于SAT的三種蛋白的表達(P<0.05,P<0.01)(見圖6、圖7、圖8和圖9)，而adiponectin的表達無明顯不同(P>0.05)(見圖6)；12wk有氧運動明顯增加了APOE-/-小鼠VAT的adiponectin表達(P<0.01)，EAT的adiponectin表達有增加的趨勢(P>0.05)，SAT的adiponectin表達有降低的趨勢(P>0.05)(見圖6)；12wk有氧運動明顯增加了APOE-/-小鼠SAT的VEGFα的表達(P<0.01)，對VAT、EAT的VEGFα的表達沒有明顯影響(P>0.05)(見圖7)；12wk有氧運動明顯降低了APOE-/-小鼠VAT、EAT的TNFα的表達(P<0.01)，對SAT的TNF-α的表達沒有明顯影響(P>0.05)(見圖8)；12wk有氧運動明顯降低了APOE-/-小鼠SAT，VAT和EAT的IL-6表達(P<0.01)(見圖9)。

圖6 不同組別adiponectin表達變化(n=8)

圖7 不同組別VEGFα表達變化(n=8)

圖8 不同組別TNF-α表達變化(n=8)

圖9 不同組別IL-6表達變化(n=8)

3 討論

3.1 有氧運動對不同脂肪組織脂代謝蛋白表達的影響

FABP4在脂肪細胞中高度表達[13]，FABP4缺乏的脂肪細胞，脂解效率降低[14]。本研究發現12wk有氧運動明顯增加了APOE-/-小鼠VAT、EAT的FABP4的表達，但對SAT的FABP4表達無明顯影響。因此，本研究認為12wk有氧運動可能增強了APOE-/-小鼠VAT、EAT脂解能力，減少了VAT、EAT脂肪的積聚。perilipin具有調節脂解作用[15]。本研究發現12wk有氧運動明顯降低了APOE-/-小鼠VAT的perilipin的表達，EAT的perilipin表達有降低的趨勢。而SAT的perilipin表達沒有明顯影響。盡管尚未有直接證據顯示perilipin水平降低對脂代謝的影響，但是Beylot等[16]研究顯示perilipin缺乏鼠，致使基礎狀態下脂肪的氧化適度增加。因此，本研究認為12wk有氧運動導致VAT的perilipin表達降低(EAT具有降低的趨勢)，可能增加了VAT脂肪氧化，減少了VAT的積聚。同時，本研究發現AC組APOE-/-小鼠VAT、EAT的FABP4顯著低于SAT的FABP4，而VAT、EAT的perilipin顯著高于SAT的perilipin，提示APOE-/-小鼠VAT、EAT較SAT可能更易導致脂肪的積聚。本研究表明12wk有氧運動導致APOE-/-小鼠VAT、EAT兩種與脂代謝相關的蛋白FABP4和perilipin產生了相似的生物學適應(并不完全一致)，而SAT的兩種蛋白并沒有發生明顯變化。

3.2 有氧運動對不同脂肪組織氧化應激蛋白表達的影響

本研究發現AC組APOE-/-小鼠的VAT、EAT中的GSH-Px含量明顯低于SAT，而Mn-SOD與Cu/Zn-SOD三種脂肪組織含量沒有明顯不同，提示VAT、EAT的抗氧化能力低于SAT。這可能是由于VAT、EAT處于更嚴重的氧化應激狀態，導致抗氧化酶過度消耗所致。Capel等人的研究與本研究相似，他們發現肥胖鼠肝臟維生素A(具有抗氧化作用)的濃度明顯低于不肥胖鼠，并且指出長期處于肥胖狀態(脂肪積聚)的小鼠抗氧化酶被過度消耗，是導致抗氧化酶濃度或活性下降的原因[17]。有研究顯示，長期規律的有氧運動通過增加GSH-Px和Mn-SOD的表達提升內源性的抗氧化能力[18]。本研究發現12wk有氧運動導致APOE-/-小鼠VAT、EAT中的GSH-Px和Mn-SOD蛋白表達明顯增加，這與前人的研究結果相似，但Cu/Zn-SOD的表達沒有明顯變化。12wk有氧運動對APOE-/-小鼠SAT的三種脂肪組織抗氧化酶的表達沒有明顯影響。本研究提示12wk有氧運動明顯提升了APOE-/-小鼠VAT、EAT的抗氧化能力，對SAT抗氧化能力沒有明顯影響。同時VAT、EAT的抗氧化酶表現出對有氧運動相同的生物學適應，二者與SAT的抗氧化酶對有氧運動的生物學適應不同(除了Cu/Zn-SOD，三種脂肪組織都未發生變化)。

3.3 有氧運動對不同脂肪組織焱性蛋白表達的影響

adiponectin是脂肪細胞分泌的一種抗炎性[19]、抗動脈粥樣硬化[20]作用的細胞因子，能夠抑制TNF-α和IL-6的產生[21]，同時adiponectin能夠刺激抗焱性細胞因子(例如IL-10和IL-1β)的合成[22]。增加體力活動量能夠增加adiponectin的水平[23]。本研究發現12wk有氧運動明顯增加了APOE-/-小鼠VAT的adiponectin的表達，EAT的adiponectin有增加的趨勢，而SAT的 adiponectin表達有降低的趨勢。本研究表明12wk有氧運動能夠增加APOE-/-小鼠的抗炎性、抗動脈粥樣硬化的作用(VAT的adiponectin表達增加所致)。TNF-α[24]和IL-6[25]是研究較多的促炎性細胞因子，在脂肪細胞中被大量表達。本研究發現AC組APOE-/-小鼠VAT和EAT的IL-6和TNF-α表達明顯高于SAT，說明VAT、EAT的炎性程度明顯高于SAT，這與Cawthorn等的研究結果一致，他們的研究也發現VAT的炎性程度明顯高于SAT[24]。12wk有氧運動明顯降低了三種脂肪組織IL-6的表達，TNF-α僅在VAT、EAT明顯降低。這表明有氧運動對脂肪組織、特別是對VAT、EAT具有明顯的抗炎性作用。12wk有氧運動導致APOE-/-小鼠VAT的抗炎性因子adiponectin表達增加(EAT趨勢增加)，這可能是IL-6和TNF-α含量減少的原因之一。另外，研究顯示FABP4具有促進血管新生的作用[26]，上述提到本研究發現12wk有氧運動明顯增加了APOE-/-小鼠VAT、EAT的FABP4水平，這可能會導致VAT、EAT血流量增加，提高了對炎性因子的氧化作用，是VAT、EAT的IL-6和TNF-α含量下降的又一原因。VEGFα，是一種促炎性細胞因子[27]，能夠促進白色脂肪組織中血管再生[24]。本研究發現AC組APOE-/-小鼠VAT、EAT的VEGFα的水平明顯高于SAT，12wk有氧運動明顯增加了SAT的VEGFα蛋白的水平，VAT、EAT的VEGFα表達沒有明顯變化。12wk有氧運動導致SAT的IL-6和VEGFα發生相反變化的原因尚不明確，可能原因是VEGFα(促進血管再生)水平升高，導致SAT血流量增加，提高了SAT的氧化作用，從而導致IL-6的水平降低。12wk有氧運動導致APOE-/-小鼠VAT、EAT四種與炎性相關的因子產生較為相似的生物學適應(并不完全一致)，而SAT中除了IL-6表現出與VAT、EAT一致的生物學適應外，其他三種因子的生物學適應并不相同。

3.4 有氧運動從脂肪組織脂代謝、氧化應激和炎性關系層面對動脈粥樣硬化的有益影響的探討

本研究發現APOE-/-小鼠VAT、EAT較SAT更易導致脂肪的積聚(VAT、EAT的FABP4明顯低于SAT，而perilipin明顯高于SAT)，從而造成VAT、EAT處于更嚴重的氧化應激狀態(GSH-Px表達明顯低于SAT)，隨之產生的促炎性細胞因子TNF-α和IL-6明顯增多(釋放入血液)，增加對血管壁的不利影響。因此，本研究認為VAT和EAT的積聚可能是動脈粥樣硬化發生的重要誘因之一。12wk有氧運動明顯增加了VAT、EAT的FABP4的表達，降低了VAT的perilipin表達(EAT有降低的趨勢)，提示有氧運動干預可能減少VAT、EAT脂肪的積聚，從而改善了VAT、EAT的氧化應激狀態，導致VAT產生的adiponectin增加(EAT趨勢增加)，隨后VAT、EAT產生的TNF-α和IL-6明顯減少(改變脂肪細胞炎性因子的異常生成)，減少了對血管壁的不利影響，對動脈粥樣硬化產生了有益影響。但是，有氧運動也可能直接通過提高VAT、EAT(本研究發現有氧運動導致GSH-Px和Mn-SOD表達明顯提高)的抗氧化能力，降低脂肪組織的氧化應激水平，改善脂肪細胞炎性因子的異常生成，對動脈粥樣硬化產生有益影響。當然，本研究也并不能排除有氧運動對脂肪細胞炎性因子本身能夠產生有益影響。肥胖(脂肪積聚)、動脈粥樣硬化和有氧運動的確切關系機制，還需要通過進一步的實驗加以研究。

4 本研究的不足之處

第一，盡管本研究表明12wk有氧運動干預能夠增加APOE-/-小鼠VAT、EAT的FABP4的表達，降低VAT、EAT的perilipin表達，可能導致脂解作用加強，但由于本研究沒有稱量AC組和AE組APOE-/-小鼠心外膜和腎周脂肪組織的質量，不能為有氧運動干預減少VAT、EAT的積聚提供直接的證據。第二，由于本研究所檢測的三種脂肪組織中脂代謝、氧化應激和炎性蛋白的數量較少(僅為9種)，對于VAT、EAT中其它蛋白或者因子是否對有氧運動產生一致或者相似的生物學適應的問題，則需要進一步研究。

5 小結

本研究首次從蛋白水平觀察了有氧運動對動脈粥樣硬化模型APOE-/-小鼠三種脂肪組織中脂代謝、氧化應激和炎性蛋白適應性表達的影響，并從脂肪組織脂代謝、氧化應激和炎性三種生理狀態關系層面這一新的角度，探討了有氧運動對動脈粥樣硬化的有益影響。本研究的主要發現有四點：(1)12wk有氧運動可能通過增加FABP4的表達和/或降低perilipin表達，減少VAT、EAT脂肪積聚；(2)12wk有氧運動有效的改善了APOE-/-小鼠VAT、EAT的氧化應激和炎性狀態，對SAT影響不明顯(除IL-6降低，VEGFα升高)；(3)12wk有氧運動導致APOE-/-小鼠VAT、EAT脂代謝、氧化應激和炎性相關蛋白表現出較為相似(并不完全一致)的生物學適應；而SAT表現的絕大部分的生物學適應與前二者不同(除IL-6，Cu/Zn-SOD)；(4)12wk有氧運動可能通過減少VAT、EAT的脂肪積聚，改善氧化應激狀態，改變脂肪細胞炎性因子的異常生成從而對動脈粥樣硬化產生有益影響。當前研究既為肥胖(脂肪積聚)、動脈粥樣硬化和有氧運動的關系研究提供一定的實驗基礎和新的研究思路，也驗證了有規律的有氧運動或者體力活動是一種有效的抗動脈粥樣硬化的行為，應該在人們的生活中得到重視。