基于Bcl-2/Bax/Caspase-3信號通路探討三七總皂苷對自身免疫性心肌炎模型大鼠心肌凋亡影響的研究

周 雪

(沈陽醫學院附屬第二醫院,遼寧 沈陽 110000)

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 研究對象：Lewis大鼠55只，SPF級，均為雄性，周齡為8周，體重200～220 g，平均(213.24±4.66) g，由廣東省醫學實驗動物中心提供[許可證號：SCXK(粵)2018-0002]。飼養在動物房中，溫度21～23 ℃，相對濕度50%～60%，定時通風換氣保持空氣潔凈，噪音<50 dB，大鼠于籠內自由活動進食，飼以全價營養顆粒飼料和無菌過濾水，定期打掃鼠籠并消毒。飼養5 d使其適應環境。

1.1.2 主要藥品與試劑：純化豬心肌肌球蛋白，美國Sigma公司產品，采用0.3 mol/L氯化鉀溶液溶解并配制為濃度10 mg/ml的豬心肌肌球蛋白溶液，-80 ℃保存備用；完全弗氏佐劑，美國Sigma公司產品；滅活結核桿菌H37Ra，購自碧迪醫療器械(上海)有限公司。三七總皂苷，CAS號：88105-29-7，純度：UV≥95%，貨號：YDS0054，規格：每瓶10 mg，購自無錫云萃生物科技有限公司，用蒸餾水溶解制成三七總皂苷溶液，濃度分別調整成10、20 mg/ml；甲氨蝶呤片，規格：每片2.5 mg，國藥準字H31020644，批號：20190112，上海上藥信誼藥廠有限公司生產，使用時采用蒸餾水溶解配制成濃度為0.1 mg/ml的甲氨蝶呤混懸液，現用現配。蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(一步法)、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamino-2-phenylindole，DAPI)染色液，購自南京凱基生物科技發展有限公司；RIPA裂解液(含苯甲基磺酰氟)、磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer，PBS)、TBST緩沖液，購自北京索萊寶科技有限公司；二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)法蛋白定量檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，購自福州飛凈生物科技有限公司；Bcl-2、Bax、Caspase-3免疫組化試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)法顯色試劑盒，購自北京伊塔生物科技有限公司；兔抗Bcl-2、Bax、Caspase-3、肌動蛋白(β-actin)多克隆抗體、山羊抗兔二抗、ECL發光試劑盒，購自翌圣生物科技(上海)有限公司。

1.1.3 主要儀器設備：超高分辨率小動物超聲影像系統(加拿大Visual Sonics，Vevo2100型)；離心機[德國Hettich，Universal 320(R)型]；光學顯微鏡(日本Nikon，Eclipse Ci型)；倒置式熒光顯微鏡(日本Nikon，Ti-E型)；電泳儀(美國Bio-rad，Power Pac 3000型)；全自動圖像工作站(美國Kodak，IS4000R型)。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模及實驗方法[6]：大鼠分成對照組(n=11)和造模組(n=44)。將10 mg/ml的豬心肌肌球蛋白溶液與完全弗氏佐劑(含滅活結核桿菌H37Ra 10 mg/ml)等體積混勻，在4 ℃條件下反復進行抽推，制成油包水狀態黏稠乳濁液，且經鑒定乳化完全。分別于第1天、第8天，造模組大鼠給予豬心肌肌球蛋白乳濁液0.2 ml后足墊皮下注射，對照組給予完全弗氏佐劑0.2 ml后足墊皮下注射；繼續喂養3 周，采用超聲心動圖檢測大鼠心功能以明確是否成功建立實驗性自身免疫性心肌炎模型。

模型建立成功的大鼠被分成模型組、三七總皂苷低、高劑量組和甲氨蝶呤組各11只。模型組、對照組分別灌胃給予蒸餾水10 ml/kg，每日1次；三七總皂苷低、高劑量組分別灌胃給予10、20 mg/ml三七總皂苷溶液10 ml/kg，每日1次；甲氨蝶呤組灌胃給予0.1 mg/ml甲氨蝶呤混懸液10 ml/kg，每周1次。各組大鼠均連續給藥4周。

（1）信息的溝通應該涵蓋各個單位的各個層次人員的交流。比如設計工程師、建設單位專業人員以及施工單位、監理人員與專業監理工程師的交流與溝通。信息溝通的工作可以以監理會議紀要、監理月報等形式進行。對項目的全過程進行監理控制，是為了使全過程成為一個有機的整體。依據施工中的不同環節的工作內容和特點制定不同的管理手段和措施，使各個工作能夠環環相扣，這是監理工程師在對項目的全過程進行監理的重要方式。

1.2.2 超聲心動圖測定大鼠心功能[6]：末次給藥12 h后，采用異氟烷吸入麻醉大鼠，仰臥位固定于檢查臺，胸前區常規備皮，用小動物超聲影像系統行超聲心動圖檢查，測定左室舒張末內徑(Left ventricular end diastolic diameter，LVIDd)、左室收縮末內徑(Left ventricular end systolic diameter，LVIDs)、左室射血分數(Left ventricular ejection fraction，LVEF)及左室短軸縮短率(Left ventricular short axis shortening rate，LVFS)。

1.2.3 標本采集與處理：超聲心動圖結束后，采用10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，然后打開胸腔，將心臟完整取出，分離心尖組織，用10%甲醛固定，經脫水、透明、石蠟包埋之后，用全自動切片機連續切制2 μm切片，貼于防脫載玻片上(經3-氨基丙基三乙氧基硅烷處理)，37 ℃干燥16 h后室溫保存，以備HE染色、TUNEL染色、免疫組化染色觀察；其他心肌組織用液氮速凍，轉移至-80 ℃冰箱，以用于Western blot法檢測。

1.2.4 HE染色法觀察心肌組織病理學變化[7]：取心肌組織切片，常規脫蠟水化，按照HE染色試劑盒說明書操作，依次采用蘇木素染色5 min、自來水洗片1 min、1%鹽酸酒精分化20 s、自來水洗片10 min、自來水返藍30 min、自來水洗片10 min、1%伊紅染色3 min、自來水洗片30 s，之后將切片分別浸入70%、80%、90%、95%酒精5 min以脫水、浸于二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液內分別5 min以透明，晾干，中性樹脂封片。

于200倍顯微鏡下，每張切片隨機采集5個不重復視野，根據炎癥浸潤程度對心肌組織進行病理學評分。標準為，0分：無炎癥細胞浸潤；1分：炎癥細胞浸潤面積不足5%；2分：5%≤炎癥細胞浸潤面積<10%；3分：10%≤炎癥細胞浸潤面積<20%；4分：炎癥細胞浸潤面積≥20%；各視野評分平均值即為該切片心肌組織病理學評分。

1.2.5 TUNEL染色法觀察心肌組織細胞凋亡情況[8]：取心肌組織石蠟切片，常規脫蠟、水化，PBS洗5 min×3次，然后滴加蛋白酶K工作液100 μl，37 ℃反應20 min，PBS洗5 min×3次，滴加DNA酶反應液100 μl，37 ℃反應30 min，按照TUNEL染色試劑盒說明書配制末端脫氧核苷酸轉移(TdT)酶反應液，并取50 μl低于切片上，37 ℃濕盒內反應30 min，PBS洗5 min×3次，滴加異硫氰酸熒光素標記的鏈霉親和素工作液50 μl，37 ℃濕盒內反應30 min，PBS洗5 min×3次，之后滴加DAPI染色液，室溫避光染色5 min，洗去染液后甘油封片。

在熒光顯微鏡下觀察并拍照，凋亡細胞核被染成綠色，正常細胞核被染成藍色。每張切片隨機采集5個未重疊視野，統計凋亡細胞以及總細胞數量，計算凋亡細胞率，各視野平均值即為該切片凋亡細胞率。

1.2.6 免疫組化染色法觀測心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3表達水平[8]：取心肌組織石蠟切片，常規脫蠟、水化，PBS洗5 min×3次，然后置于0.3%過氧化氫中10 min以滅活內源性過氧化物酶，無菌蒸餾水洗3次，置于PBS內微波爐加熱煮沸以修復抗原，滴加5%牛血清白蛋白，37 ℃反應30 min，之后參照試劑盒說明書滴加Bcl-2、Bax、Caspase-3一抗，4 ℃反應18 h，PBS洗10 min×3次，滴加生物素標記的山羊抗兔IgG，37 ℃反應30 min，PBS洗10 min×3次之后，用DAB試劑盒顯色及蘇木素復染，常規封片。

于400倍顯微鏡下，每張切片隨機采集5個未重疊視野，通過Image-pro plus 6.0軟件分析各視野細胞陽性率，計算平均值。

1.2.7 Western blot法檢測大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達水平[8]：將-80 ℃保存的心肌組織剪碎，與RIPA裂解液混合，冰上靜置10 min，充分研磨后采用超聲破碎儀破細胞壁，4 ℃，14000 r/min×10 min離心，取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度；然后配制SDS-PAGE分離膠和積層膠，放入電泳槽內；取適量蛋白質樣品與5×上樣緩沖液4∶1混勻，于沸水中處理20 min使蛋白變性；上樣，電泳(恒壓80 V 25 min，恒壓120 V 90 min)至溴酚藍跑到分離膠下緣；將目的蛋白轉至硝基纖維素(NC)膜上，5%脫脂牛奶搖床封閉1 h，NC膜放入1∶1000稀釋的Bcl-2、Bax、Caspase-3、β-actin一抗中，4 ℃反應16 h后，TBST洗10 min×3次；NC膜置于羊抗兔二抗工作液(1∶2000稀釋)內，37 ℃反應1 h后，TBST洗10 min×3次；最后采用ECL發光試劑盒顯影。

采用全自動圖像工作站采集圖像，對分離獲得的蛋白條帶的灰度值進行分析，計算Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相對內參β-actin的表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，多組之間的比較用單因素方差分析，組間多重比較分析用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠心功能指標比較 見表1。模型組LVEF、LVFS水平明顯低于對照組，LVIDd、LVIDs水平顯著高于對照組(P<0.05)。與模型組比較，三七總皂苷低、高劑量組和甲氨蝶呤組大鼠LVEF、LVFS水平較高，LVIDd、LVIDs水平較低，差異有統計學意義(P<0.05)，且三七總皂苷干預組呈現一定量效關系。

表1 各組大鼠LVIDd、LVIDs、LVEF及LVFS水平比較

2.2 各組大鼠心肌組織病理學觀察結果 HE染色結果顯示，對照組心肌細胞結構完整，排列規整，極少見炎癥細胞浸潤；模型組大鼠心肌細胞排列松散，有大量炎性細胞浸潤間質、肌束間，存在小血管擴張充血，少量心肌細胞脂肪變性；三七總皂苷低、高劑量組及甲氨蝶呤組心肌細胞排列緊密，炎癥細胞浸潤情況較模型組不同程度改善，偶見小血管擴張充血，其中三七總皂苷高劑量組及甲氨蝶呤組改善最明顯(圖1)。

A:對照組； B:模型組； C:三七總皂苷低劑量組； D:三七總皂苷高劑量組； E：甲氨蝶呤組圖1 各組大鼠心肌組織病理學改變(HE染色，×200)

2.3 各組大鼠心肌組織病理學評分比較 見表2。模型組的心肌組織病理學評分高于對照組(P<0.05)。與模型組比較，三七總皂苷低、高劑量組和甲氨蝶呤組大鼠心肌組織病理學評分較低，差異有統計學意義(P<0.05)，且三七總皂苷干預組呈現一定量效關系。

表2 各組大鼠心肌組織病理學評分比較(分)

2.4 各組大鼠心肌組織細胞凋亡率比較 見表3(圖2)。TUNEL染色結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠心肌組織細胞凋亡率顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，三七總皂苷低、高劑量組和甲氨蝶呤組大鼠心肌組織細胞凋亡率較低，差異有統計學意義(P<0.05)，且三七總皂苷干預組呈現一定量效關系。

表3 各組大鼠心肌組織細胞凋亡率比較(%)

2.5 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3表達免疫組化檢測水平比較 見表4(圖3～5)。免疫組化檢測結果顯示，模型組心肌組織Bcl-2表達水平低于對照組，Bax、Caspase-3表達水平高于對照組(P<0.05)。與模型組比較，三七總皂苷低、高劑量組和甲氨蝶呤組大鼠心肌組織Bcl-2表達水平較高，Bax、Caspase-3表達水平較低，差異有統計學意義(P<0.05)，且三七總皂苷干預組呈現一定量效關系。

A:對照組； B:模型組； C:三七總皂苷低劑量組； D:三七總皂苷高劑量組； E：甲氨蝶呤組圖2 各組大鼠心肌組織細胞凋亡情況(TUNEL染色，×200)

表4 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3表達免疫組化檢測水平比較(%)

A:對照組； B:模型組； C:三七總皂苷低劑量組； D:三七總皂苷高劑量組； E：甲氨蝶呤組圖3 各組大鼠心肌組織Bcl-2表達情況(免疫組化染色，×400)

A:對照組； B:模型組； C:三七總皂苷低劑量組； D:三七總皂苷高劑量組； E：甲氨蝶呤組圖4 各組大鼠心肌組織Bax表達情況(免疫組化染色，×400)

A:對照組； B:模型組； C:三七總皂苷低劑量組； D:三七總皂苷高劑量組； E：甲氨蝶呤組圖5 各組大鼠心肌組織Caspase-3表達情況(免疫組化染色，×400)

2.6 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3表達Western blot檢測水平比較 見表5(圖6)。模型組心肌組織Bcl-2表達低于對照組，Bax、Caspase-3表達水平高于對照組(P<0.05)。與模型組比較，三七總皂苷低、高劑量組和甲氨蝶呤組大鼠心肌組織Bcl-2表達水平較高，Bax、Caspase-3表達水平較低，差異有統計學意義(P<0.05)，且三七總皂苷干預組呈現一定量效關系。

表5 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3表達水平Western blot檢測比較

A:對照組； B:模型組； C:三七總皂苷低劑量組；D:三七總皂苷高劑量組； E：甲氨蝶呤組圖6 Western blot法檢測大鼠心肌組織Bcl-2、Bax、Caspase-3表達結果

3 討 論

心肌炎最常見的類型為病毒性心肌炎，該病發生的第一階段為早期病毒直接刺激心肌細胞導致心肌損傷和功能障礙，第二階段則是自身免疫階段，病毒持續感染過度激活機體抗原-抗體反應，肌球蛋白等自身抗原促進B細胞釋放抗心磷脂抗體、抗肌球蛋白等自身抗體，使心肌細胞發生免疫損傷，進一步發展為以進行性心衰為特征的DCM，即第三階段，影響預后[9]。可見，自身免疫反應是誘發DCM的重要機制[10]。有研究稱，在自身免疫反應心肌細胞損傷及轉變為以進行性心衰為特征的DCM過程中，凋亡起著十分重要的作用[11]。所以，抗細胞凋亡有可能成為減輕免疫性心肌炎損傷，抑制心肌炎發展為DCM的作用靶點之一。中醫認為，該病屬于“風溫”“心悸”“心癉”“胸痹”等疾病范疇，多因素體虛弱，心氣不足，溫邪侵襲傷及于心所致，心主血脈，外邪侵襲可使血性不暢，阻于脈內，形成血瘀，需用活血化瘀之法通利血脈，恢復血行。三七味甘、微苦，性溫，歸心、肝、脾經，有化瘀止血，活血定痛之效，為常用的活血化瘀中藥，也是治療病毒性心肌炎常用的有效單味中藥之一。三七總皂苷是三七中三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和Rg1等成分的總稱，可以發揮抑制炎癥反應、免疫調節、延緩纖維化、抑制心肌缺血、抗氧化應激等多方面功效[12-13]，在心腦血管系統、免疫系統中的應用較多。有研究發現[14]，三七總皂甙可能通過抑制膜型基質金屬蛋白酶-1表達，來對病毒性心肌炎小鼠發揮治療作用；有學者[15]進行的體外研究則認為，三七總皂苷通過調控Bcl-2/Bax表達來抑制血管緊張素Ⅱ誘導的心肌細胞凋亡，起到心肌損傷保護作用。這些研究的結果為本次研究三七總皂苷對EAM大鼠Bcl-2/Bax/Caspase-3信號通路的影響提供了一定的理論支持。

EAM動物模型是研究自身免疫性心肌炎及病毒性心肌炎自身免疫反應發病機制、診斷、治療等的重要基礎，常用的誘導方法有心肌自身抗原、心肌自身抗原表位、活化自身免疫細胞等[16]，不同的誘導方式在病理改變和病情嚴重程度方面有所差異。有日本學者采用豬的心肌球蛋白成功誘導了EAM大鼠模型[17]，其發展進程與人巨細胞性心肌炎類似，且可進展為DCM，是較為理想的模型。本次研究即采用這種方法，給予Lewis大鼠純化的豬心肌肌球蛋白乳濁液皮下注射，結果發現，模型組大鼠心功能指標LVEF、LVFS水平明顯降低，LVIDd、LVIDs水平顯著升高，HE染色結果也顯示心肌大量炎性細胞浸潤間質、肌束間，存在小血管擴張充血，提示EAM模型建立成功，而經三七總皂苷干預后，上述的心功能指標均得到明顯改善，心肌組織病理學評分也較模型組顯著降低，表明三七總皂苷確實能夠減輕EAM大鼠炎癥改變，促進心臟功能恢復，并且治療作用與藥物劑量有關。

細胞凋亡是引起心肌損傷的方式之一。細胞凋亡涉及到內源性、外源性兩條重要的途徑，其中Bcl-2蛋白家族主要調控的線粒體介導內源性凋亡途徑在細胞凋亡研究中最受重視。Bcl-2蛋白家族包括兩類蛋白，Bcl-2主要在神經和淋巴系統表達，具有抑制細胞凋亡的作用；而Bax在各種組織廣泛表達，不僅能拮抗Bcl-2抑制凋亡的作用，還能直接加速細胞凋亡。有研究稱[18-21]，免疫性心肌炎過程中有心肌細胞凋亡存在，而多種心臟病心肌細胞凋亡的調控與Bcl-2和Bax有關。本次研究結果中模型組心肌組織Bcl-2表達水平較對照組降低，Bax表達水平和細胞凋亡率較對照組升高也證實了這一觀點。Caspase-3為凋亡途徑關鍵效應分子[22-25]，兩條細胞凋亡途徑最后都會引起Caspase-3活化，剪切多聚(ADP-核糖)聚合酶PARP，使核小體間的DNA裂解而引起細胞凋亡，也標志著細胞凋亡浸入不可逆階段[26-29]。本研究結果顯示，與模型組比較，三七總皂苷低、高劑量組和甲氨蝶呤組大鼠心肌組織細胞凋亡率較低，心肌組織Bcl-2表達水平較高，Bax、Caspase-3表達水平較低，且三七總皂苷干預組呈現一定量效關系，表明三七總皂苷能有效促進EAM大鼠心肌組織抗凋亡蛋白Bcl-2表達，抑制促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達，減少心肌細胞凋亡，促進心肌損傷減輕。

綜上所述，三七總皂苷能劑量依賴性的改善EAM大鼠心功能，減輕心肌炎癥病理變化，抑制細胞凋亡，其作用可能與調節Bcl-2/Bax/Caspase-3信號通路中凋亡相關蛋白表達有關。