針灸對體外受精促排卵周期中卵泡發育及優質胚胎的影響

蘭 穎，陳 瑤 ，吳 節

(1.成都中醫藥大學附屬醫院，四川 成都 610072;2.內江市第一人民醫院，四川 內江 641099)

卵巢功能障礙是降低女性生育力、引起不孕癥的重要因素之一。促進卵泡發育，獲取成熟卵母細胞和優質的胚胎是體外受精-胚胎移植(In vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)成功的前提[1]。臨床證據已證實針灸能夠通過改善卵巢功能、提高取卵數量及質量、促進胚胎著床等多條途徑實現對IVF-ET 臨床妊娠率的積極影響[2-5]。中醫認為女性腎氣盛，天癸至，沖任氣血調暢是胎孕的基礎。若先天稟賦不足或房事不節，損傷腎氣、沖任不調，則不能攝精成孕。故補腎益氣，調攝沖任是首要原則。因此深入研究針灸在IVF-ET 各環節中改善妊娠結局的作用，對中醫助孕的前景有著重要的臨床意義。

本研究在促排卵期間，采用B超動態監測卵泡發育情況，了解針灸如何影響卵泡動態發育和優質胚胎率。研究結果將對合理安排針灸干預啟動時機和療程，優化卵母細胞質量、提高優質胚胎率，最終改善妊娠結局有著十分重要的參考價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 受試者來源于2018年3月至2019年12月期間成都附屬醫院治未病中心門診病例。病例納入標準：①年齡21～45歲；②符合2012年美國生殖醫學會頒布的女性不孕癥診斷標準[6]；③符合IVF-ET適應癥，配偶身體健康；④明確研究內容及風險，自愿參加并簽署書面知情同意書。同時滿足上述4項標準，方可納入。排除標準：①由輸卵管、子宮、免疫或遺傳問題引起的不孕癥患者；②有針灸禁忌、出血傾向、過敏體質、酒精或藥物濫用者。符合以上任意一項均予以排除。

通過https://www.medsci.cn/網站隨機化工具產生的隨機數字，使用順序編號、不透明的信封逐一裝好隨機數字卡片并封口，受試者按就診順序領取對應編號的信封獲得隨機分組信息。三組分別為安神補腎針灸治療組，常規針灸組以及對照組。本研究方案設計符合醫學倫理學要求，由四川省中醫藥區域倫理審查委員會審查通過(審查批件號：2018KL-015)。

共納入受試者99例，每組各33例。入組后對照組1例受試者入組后自然妊娠，故未進行后續干預和數據采集。安神補腎針灸組中平均年齡31.30歲;平均病程50.55個月。常規針灸組平均年齡31.70歲；平均病程51.70個月。對照組平均年齡32.69歲；平均病程50.25個月。各組一般資料如受教育程度、不孕癥類型、不良妊娠次數、生產次數、失敗周期數組間比較差異無統計學意義。各項激素指標雌二醇(Estradiol,E2)、孕激素(Progesterone,P)、促卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)、促黃體生成素(Luteinizing hormone,LH)、抗繆勒管激素(Anti mullerian hormone,AMH)及竇卵泡計數(Sinus follicle count,AFC)組間比較差異無統計學意義。見表1。

表1 各組受試者血清激素水平及竇卵泡計數比較

1.2 治療方法

1.2.1 對照組：僅接受促排卵藥物刺激方案。促排卵：①于前1個月經周期的黃體中期(月經來潮第21天前后)一次性注射促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a Gonist,GnRH-a)0.4 mg降調節；②在下個月經周期第3天開始注射促性腺激素 225 IU促排卵，每天1次直至人體絨膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin,HCG)注射日前1 d；③在月經周期第6天給予GnRH-a曲普瑞林，每天1次，每次0.1 mg，持續至HCG注射日。當2～3個主導卵泡直徑達到18 mm、E2水平高于500 pg/ml時，于當晚21：00時注射HCG 250 μg，36 h后超聲引導下行陰道穿刺取卵術。將獲取的卵母細胞置于37 ℃的恒溫培養皿中。

體外受精：HCG注射后38～40 h加配偶精子，加精時雙人核對并記錄時間、加精量。30～50 μl的液滴內加精5000～10000條，或在1 ml的培養液內加精15萬～30萬條。將精卵共培養18～20 h，后觀察受精結果。

1.2.2 常規針灸組：在促排卵周期中給予常規針灸方案。選穴方案：關元(灸)、氣海、歸來、子宮、腎俞、命門(灸)、三陰交、太溪。穴位定位參考中國國家標準化管理委員會2006年頒布的中華人民共和國國家標準《腧穴名稱與定位》(GB/T12346-2006) 。治療周期自進入促排卵周期當天開始，直至取卵日前1 d。采用0.35 mm直徑，1～1.5寸毫針針刺，得氣后留針30 min，10 min行針1次，每日治療1次，每個療程連續5次，療程間間隔2 d。第奇數次選用正面穴位，受試者取仰臥位，第偶數次選用背面穴位，取俯臥位。針灸干預由具有5年以上經驗的針灸臨床醫師實施。

1.2.3 安神補腎針灸組：在促排卵實施的過程中給予安神補腎針灸干預方案。選穴方案：神庭、合谷、太沖、三陰交、關元、足三里、神闕(灸)、百會、肝俞、脾俞、腎俞、命門(灸)。施術方式、療程同常規針灸組。

1.3 觀察指標

1.3.1 主要結局指標：優質胚胎率，經顯微鏡下觀察胚胎形態評定。

1.3.2 次要結局指標：經陰道彩超動態檢測進周后卵泡發育情況，記錄進周當天、進周第7天、HCG注射日發育卵泡個數、卵泡平均直徑(卵泡最大切面的兩條垂直徑線的平均值)，促排天數、取卵數、受精率、兩個原核(2 Pronucleus,2PN)的胚胎率、優質胚胎數/率及囊胚形成率。

1.3.3 基本病情相關指標：不孕癥類型、不良妊娠次數、生產次數、未避孕未孕月數、FSH、LH、E2、AMH、AFC水平[7]。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0 統計學軟件進行分析。計量資料先進行正態分布檢驗，以“均數±標準差”表示，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，非正態分布數據以“中位數(25%百分位數，75%百分位數)”表示，采用Mann-Whitney非參數檢驗。采用雙側檢驗法，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組卵泡發育情況對比 見表2、3。 各組受試者進周當天卵泡個數、卵泡平均直徑、促排天數均具有可比性的前提下，HCG注射前7 d，兩個針灸組平均卵泡直徑顯著超過對照組(P=0.003)，前兩者比較差異無統計學意義，但以安神補腎針灸組的卵泡直徑增長最快。HCG注射當日兩個針灸組平均卵泡直徑分別為18.25(17.81,18.89)mm和18.25(17.45,18.87)mm，組間比較差異無統計學意義，但都顯著高于對照組的17.48(15.93,18.60)mm。在卵泡個數方面，三組在基線、HCG注射前7 d及HCG注射日三個監測時間點的數據組間比較無統計學差異，但安神補腎針灸組受試者在HCG注射當日，直徑大于14 mm的卵泡個數占優，與另外兩組相比均具有統計學差異(P=0.020)。說明針灸可以促進促排卵期卵泡的發育，且使卵泡生長的同步性更好。

表2 促排卵期各組卵泡平均直徑與促排天數比較

表3 促排卵期各組卵泡個數比較(個)

2.2 各組取卵、受精及優質胚胎情況比較 見表4。經歷相同的促排期后，三組受試者取卵個數比較差異無統計學意義(P=0.696)，但受精率以安神補腎針灸組最高，常規針灸組次之，且與對照組比較存在統計學差異(P<0.05)。2PN胚胎率三組之間基本一致(均P=0.820)。優質胚胎個數仍以安神補腎針灸組最高，常規針灸組次之，與對照組之間兩兩對比差異無統計學意義。但優質胚胎率的比較中，安神補腎針灸組、常規針灸組、對照組分別為0.50(0.44,0.60)、0.38(0.25,0.50)、0.33(0.00,0.57)，兩個針灸組之間比較差異無統計學意義，但對照組同兩個針灸組之間比較存在統計學差異(P=0.011)。囊胚形成率組間比較并無統計學差異。

表4 各組取卵及受精卵發育情況比較

2.3 不良反應 3例輕度不良反應事件，均為取針后局部血瘀，其中1例為安神補腎針灸組，2例為對照組，組間比較無統計學差異(P=0.555)。囑受試者當日保持血瘀處局部干燥清潔，未行其他處理。

3 討 論

中醫認為女性不孕歸屬“全不產”“無子”“斷緒”等范疇。腎氣盛，天癸至，沖任氣血調暢是胎孕的基礎。若先天稟賦不足或房事不節，損傷腎氣、沖任不調，胞脈失于溫煦，則不能攝精成孕[8]。中醫治療該病，補腎益氣，調攝沖任是首要原則[9-10]。本研究通過觀察針灸干預促排卵期間卵泡的發育情況，發現針刺能促進促排卵期間卵泡的發育，并提高體外受精率和優勢胚胎率，可為胚胎移植奠定堅實的基礎。

首先，結果發現促排卵期間針灸干預對受試者卵泡個數影響不大，但能促進卵泡生長和發育的同步。目前，臨床最常用的方法既是采用B超測量卵泡大小，卵泡的數量和生長的同步性是把握促排藥物劑量和注射促性腺激素啟動時機的重要參數。已有研究證實[11]針刺可有效提高取卵前卵泡膜血流指數，從而提高卵母細胞質量、優勢胚胎率，結論與本研究一致。對卵巢功能障礙的不孕人群，針刺不僅能促排卵可改善生殖激素水平，還能促進卵泡發育[12-13]。自然狀態下的卵泡發育到18～22 mm是其破裂排卵的時機，但在輔助生殖技術誘發的卵泡生長周期中對卵泡大小的監測需更加謹慎：當單個或一批主導卵泡直徑超過14 mm時，是判斷取消周期或使用拮抗劑的一個重要信號[14]。本研究發現在HCG注射日當天，安神補腎針灸組受試者平均卵泡直徑最大，且直徑大于14 mm的卵泡個數最多，說明針灸療法不僅能促進卵泡長大，還能優化卵泡發育的同步性。若卵泡直徑相差過大，外源性Gn的啟動可能加大卵泡發育的不同步，最終降低取卵個數，因此針灸是提高取卵數的又一保障。

在取卵和受精情況的比較中，三組的取卵個數基本持平，但兩個針灸組的受精率、優質胚胎率均高于對照組。這種差異與針灸療法及穴位的特異性效應相關。安神補腎組的選穴方案以神庭、四關、三陰交為主穴，是以中醫“心腦-腎氣-天癸-沖任-胞宮” 生殖軸的新模式，并認為它與現代醫學“大腦皮層-下丘腦-垂體-卵巢-子宮生殖” 軸的神經內分泌調節系統相似[15]。神庭重在調節心神與腦神，三陰交平衡肝、脾、腎，四關重在通達氣血。三組穴位配合，貫穿心腦、腎氣與陰陽，整體調節生殖軸，使精血充足，沖任有養，促進卵泡發育。本次療程是根據促排卵周期安排的，從促排卵當天開始，直至取卵前1 d，針灸治療10～11次，總療程不超過2周。安神補腎針灸組和常規針灸組之間各結局指標僅存在變化趨勢，并無統計學差異，考慮為療程不夠。中醫藥參與IVF-ET的時機應該從進促排卵周期前開始，改善患者卵巢功能和子宮內膜容受性，為胚胎移植打下堅實的基礎[16-17]。通過對針刺改善IVF-ET臨床妊娠率的研究分析，發現大多干預周期均在進周前1～4個月經周期開始，足療程的針灸干預會提高獲卵數、受精率、可利用胚胎率，并最終提高臨床妊娠率[18-19]。

本研究在實施過程中，也存在一些局限：①未進行中醫辨證分型，若是肝郁伴腎陽虛的患者，配合安神補腎針灸方案可能在臨床妊娠率上獲效更優；② 受設備的限制，沒能完整監測卵泡的長、寬、高，只有三維數據才能更好地反映卵泡的形態變化，甚至可能挖掘出針刺對卵泡形態學發育的修正效果；③未對妊娠率進行統計，由于納入受試者取卵后行新鮮胚胎移植和冷凍復蘇胚胎移植比例組間不均衡，且行凍胚移植的時間距取卵的時間個體間差異較大，并未隨訪到所有受試者的胚胎移植及妊娠情況；④未采集到受試者取卵前激素水平，這些指標能在一定程度上幫助評估胚胎著床的成功率[20]。一是并非所有受試者在取卵前都經激素水平的監測，二是在監測了激素水平的受試者采血的時間點根據其促排卵周期長短的差異不盡相同，因此這部分數據不完整且不具有時間上的統一性。

為進一步驗證針刺效應，需根據不孕癥患者的基本情況和所處的周期，設計符合針刺即時效應、遠期效應特點的干預方案，并選擇合適的評價指標針對IVF-ET各關鍵階段進行動態結果追蹤，保證針刺實施的質量和刺激量，才能真正體現出針刺助孕效應，拓寬針刺助孕的應用前景。