基于網絡藥理學方法赤芍-牡丹皮藥對治療中風作用機制探討

馬懷芬，龍凱花，朱鳳霞，孟婷婷，王春柳

(1.西安培華學院，陜西 西安 710125；2.陜西省中醫藥研究院，陜西 西安710003)

中風是一種存在于臨床中的、普遍的神經疾病，主要表現為突然昏厥、患者大部分都會出現身體正常功能嚴重受損的后遺癥，即平常所說的半身不遂、言語不清。發病后患者生理變化非常明顯，容易造成殘疾。它主要包括缺血性中風以及出血性中風兩種。常是因為血管堵塞造成的大腦血管破裂，從而造成腦組織損傷[1-2]。由于該病復發率、病死率、致殘率高，對中老年的健康及生活質量帶來嚴重威脅，患者存活后，遺留不同程度致殘，常見失語、偏癱和認知障礙等臨床表現[3-4]。西醫臨床常采用組織纖溶酶原激活物治療，但不良反應較多，如治療時間窗短、增加病死率及神經毒性等，還采用抗凝藥物治療，但療效不理想。所以，找到更加高效的治療方案以及藥物成為了醫學研究目標。

中風主要是由于內虛邪中，陰陽失調，上腦而失清，其受到虛、火、風、痰、氣、血等多種因素的影響。在提高存活率、預后生存質量，降低病死率、致殘率等方面，中醫治療中風具有豐富的臨證經驗。赤芍、牡丹皮均為毛茛科植物,兩者化學成分類似，均為清熱涼血藥，臨床常相須為用，協同增效。赤芍性苦，破瘀血，散血塊[5-6]；牡丹皮味酸，破血、行血[7-8]，為中醫臨床活血化瘀、治療中風病常用藥對，用于血瘀輕癥。但藥對赤芍-牡丹皮用于治療中風的關鍵作用靶點，作用機理及信號通路等方面目前仍未闡明清楚。為闡明藥對的作用機制，運用網絡藥理學分析其可能的作用機制。網絡藥理學主要從分子與基因水平兩方面分析藥物的作用靶點，以此探究藥對赤芍-牡丹皮治療中風的作用機制[9]，揭示赤芍-牡丹皮藥對治療中風的多靶點、多通路協同作用機制。

1 材料與方法

1.1 采用及參考的數據庫 見表1。采用及參考的數據庫包含有TCMSP、DAVID、STRING等。

表1 采用及參考的數據庫信息

1.2 篩選藥材化學成分-疾病靶點 充分發揮中藥系統藥理學分析平臺的作用(TCMSP)，本文選擇了赤芍與牡丹皮來當作主要分析對象，探究了赤芍與牡丹皮主要包括哪些化學成分。

1.3 篩選活性有效化合物 篩選條件：查閱相關中藥的活性成分，如：赤芍與牡丹皮，并對相關的目標活性成分群進行確定。化合物類藥性(DL)必須≥0.18，口服生物利用度(OB)必須≥30%。

1.4 中風和活性成分的靶點獲取 本文主要是從TCMSP數據庫、Drug Bank數據庫以及Genecards 數據庫找到了分析中風相關的靶點所需要的資料。

1.5 網絡構建與分析 采用線維恩軟件對相關的成分與疾病靶點的交集靶點進行了繪制，再由STRING數據庫搜集到的相關資料，成功繪制出了蛋白互作網絡圖。根據交集靶點，歸屬相對應的活性成分；運用Cytoscape 3.7.0分別繪制PPI網絡圖和疾病-藥材-活性成分-靶點網絡圖。

1.6 基因功能富集分析與生物過程分析 借助DAVID數據庫探討了中藥赤芍以及牡丹皮的核心作用靶點，對現階段關注度比較高的GO功能與KEGG 通路富集做了相關研究。

2 結 果

2.1 篩選藥材化學成分-疾病靶點 從TCMSP數據庫中，收集赤芍、牡丹皮中ADME性質符合要求化合物共計40種化學成分，其中來自赤芍的有29種，來自丹皮的有11種，上述化學成分相關靶點共174個。

去重復后，通過四個數據庫(TCMSP、Drug Bank、TTD、Genecards)得到總計167個作用靶點都與中風相關，再在UniProt數據庫將這些靶點信息傳輸進來即可轉化為Official Gene Symbol(圖1)。

圖1 赤芍-牡丹皮藥對活性成分-靶點與疾病靶點PPI網絡

基于PPI圖歸屬的活性成分共有17種，見表2。其中豆甾醇和兒茶素是赤芍和牡丹皮共有成分。

表2 赤芍-牡丹皮的化合物信息

網絡拓補分析顯示，網絡拓補學參數BC、CC、Degree同時滿足大于均值成分作為活性成分，分別為槲皮素、山奈酚、黃芩苷、鞣花酸4個成分(圖2)。

圖2 赤芍-牡丹皮藥對疾病-藥材-活性成分-靶點網絡

在這個環節，需要把交集靶點還有其所屬通路映射關系傳輸到Cytoscape 3.7.0中去，此時就可以得出潛在靶點-通路網絡(圖3)。對圖3進行網絡拓補分析可知，網絡拓補學參數BC、CC、Degree同時滿足大于均值靶點作為核心靶點，22個核心靶點分別為：AKT1、MAPK1、MAPK8、JUN、TNF、IL6、FOS、TP53、TGFB1、CCND1、IL1B、EGFR、CASP3、BCL2、GSK3B、BAX、VEGFA、CXCL8、CASP8、STAT1、MYC、MMP9。

圖3 赤芍-牡丹皮藥對治療中風潛在靶點-通路網絡

2.2 KEGG與GO分析 在閾值為P< 0.05的條件下，通過 DAVID 數據庫對有效活性成分的作用靶點進行KEGG 通路富集分析與GO功能注釋，得到了排名在前幾位的生物過程與通路繪圖(圖4、5)。

圖4 赤芍-牡丹皮藥對治療中風潛在靶點GO功能注釋

圖5 赤芍-牡丹皮藥對治療中風潛在靶點KEGG分析

以上圖中可以看出，BP主要集中在活性氧代謝過程、有毒物質及脂多糖等相關反應中，并且還可以觀察到：MF集中蛋白異源二聚體活性、核受體活性、細胞因子受體進行結合，CC功能集中膜微區與囊腔功能，初步推斷藥對赤芍-牡丹皮主要通過以上途徑治療中風。在對赤芍-牡丹皮藥對治療中風潛在靶點KEGG通路分析后，按照每條通路上富集靶點數量排名前10位的通路有VERF通路、Toll樣受體通路、TNF通路、IL-17信號通路、P13K-Akt通路等。

3 討 論

中風的病理過程比較難以理解，其主要表現為突然昏厥、患者大部分都會出現身體正常功能嚴重受損的后遺癥，即平常所說的半身不遂、言語不清。赤芍、牡丹皮均為毛茛科植物,兩者化學成分類似，均為清熱涼血藥，臨床常相須為用，協同增效,為活血化瘀常用藥對[10-11]。而本文所研究的赤芍，其化學成分包括赤芍苷、有機酸、黃酮類、糖類及揮發油等，具備了多種藥理效果，比如說抗凝、有效減小血液黏稠度、使得人體微循環更加順利；并且還能夠舒通血管[12]，牡丹皮的化學成分包括了酚及苷類成分、單萜及其苷類成分、三萜類成分、香豆素類成分等多種，具備了多種藥理效果，比如說疏通血管、可以有效降糖、促進機體免疫系統功能的發揮，并且還可以抑菌抗炎[13]。

赤芍-牡丹皮藥對能夠促進中風患者的恢復[14]，在網絡藥理學方法基礎上，對赤芍-牡丹皮藥預防中風的效果以及原理作了相關研究。在目前得到的重點靶點中，靶點TNF、IL-6、IL-10是常見的炎癥氧化應激等通路靶點，在中風的病理過程中多有報道[15-17]；KEGG分析得到的通路如TNF 是凋亡相關的經典信號通路。藥對中含有β-谷甾醇，可通過抑制 TNF 相關信號通路，產生免疫調節反應，可以作用于炎癥的多個環節[18]。IL-17 屬于人體的其中一種細胞因子，其生物學活性比較有代表性，能參與人體大多數的炎性反應過程[19]，研究結果表明，中風患者發生病變的周圍組織中 IL-17 表達過高且活性強度增加，因此炎性反應加重，并誘發細胞出現損傷，使得病情加劇惡化[20]。與氧化作用有關的HIF1 通路中釋放的轉錄因子HIF-1α，是一種在缺氧的微環境下能使機體細胞發揮關鍵作用的因子。使機體細胞在缺氧的環境下能提高活性，主要通過調控相關基因轉錄與表達的方式，使機體細胞在缺氧的環境中適應低氧狀態。研究結果指出，中風患者避免不了腦水腫區域的產生，該區域會讓其附近組織呈現低氧，導致血清中 HIF-1α 的水平大幅度上升。

初步分析發現在赤芍-牡丹皮藥對化學成分與中風最為密切相關的為槲皮素、山奈酚、黃芩苷、鞣花酸4個化學成分。其中鞣花酸和黃芩苷是赤芍的活性成分，槲皮素、山奈酚為牡丹皮的活性成分，鞣花酸雖然沒有在赤芍/牡丹皮中作為主要活性成分，但從分析結果看，鞣花酸也可能是治療中風的潛在強活性成分。當前赤芍的質量控制成分為芍藥苷，牡丹皮的質控成分為丹皮酚，只是可能基于研究熱度等原因未能排列在最前面，但在本文的分析中上述兩種成分也屬于核心藥效成分。在此基礎上，研究結果能夠指導赤芍-牡丹皮物質基礎研究。

在網絡藥理學方法基礎上，詳細探討了赤芍-牡丹皮藥對治療中風患者的原理以及可以起到的效果，發現赤芍-牡丹皮藥對可能是通過VERF通路、Toll樣受體通路、TNF通路、IL-17信號通路、P13K-Akt等通路協同作用發揮治療/緩解中風功效，上述預測結果可為赤芍-牡丹皮藥對在中風治療的藥理作用研究及臨床應用提供一定的理論依據，但還需要先一步的實驗研究。