蒿屬香豆素對MCD飲食誘導的非酒精性脂肪性肝纖維化小鼠保護性作用的研究

蔡 菁 ，葛亞強 ，許麗娟 ，陸華美

(1.江蘇大學附屬武進醫院，江蘇 常州 213017;2.徐州醫科大學武進臨床學院，江蘇 常州 213017)

非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)發展始于脂肪肝，經非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis，NASH)，后隨著病情進一步惡化，發展為肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌，還會增加患者心血管疾病的發病風險[1-2]。隨著生活方式和飲食結構的改變，肥胖、糖尿病、代謝綜合征全球化流行，NAFLD的發病率也逐漸升高。因此，及時治療顯得至關重要。目前，研究認為肝過度攝入脂肪和氧化應激在NAFLD 的病理發展過程中有十分重要的作用[3]。然而針對NAFLD 還未有療效顯著的治療方案，臨床上主要通過干預患者生活方式、保肝護肝、降脂調脂、調節腸道菌群等方式改善癥狀，目前為止，臨床缺乏療效確切的抗肝纖維化藥物。中藥具有多環節、多靶點的作用特點，對病理機制復雜的疾病可發揮綜合優勢，近年來，實踐證明中醫藥在抗器官纖維化中具有良好作用與發展前景[4-7]。

中醫治療肝纖維化的主要方法是辨證論治，抗肝纖維化藥物中主要包含中藥有丹參、黃芪、川芎等[8-10]。由茵陳、梔子、大黃組成的茵陳蒿湯具有抗炎、抑制肝脂肪變性，抗凋亡、壞死，保護腸道黏膜屏障和免疫調節的作用[11-12]。茵陳藥理學研究顯示具有利膽、降脂、解熱抗炎、護肝等作用。主治：黃疸、肝炎等，而蒿屬香豆素(Scoparone)是中藥茵陳的主要成分，已有研究結果表明，蒿屬香豆素具有廣泛的藥理活性，包括降血脂、抗炎、抗氧化、抗凋亡等[13]。本實驗探討蒿屬香豆素這一中藥成分在蛋氨酸膽堿缺乏(Methionine-choline-deficient，MCD)誘導的非酒精性脂肪性肝纖維化小鼠中作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性ICR小鼠，體重20 g左右，SPF級，購自常州卡文斯實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK(蘇)2016-0010，飼養于江蘇大學實驗動物中心，飼養條件為室溫21～23 ℃，濕度55%～65%。

1.2 試劑與儀器 蒿屬香豆素、丹酚酸B購自美國Sigma公司、平滑肌肌動蛋白(α-Smooth muscle actin，α-SMA)、Ⅰ型膠原抗體、轉化生長因子β1(Transforming growth factor beta,TGF-β1)蛋白抗體、E鈣黏蛋白抗體購自Abcam公司，MCD飼料及普通飼料購自江蘇美迪森生物醫藥公司。AST、ALT、BUN、Cr檢測試劑盒、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)試劑盒購自南京建成公司。波形蛋白抗體、Smad2/3總蛋白、p-Smad2/3抗體購自美國CellSignaling Technology公司，Smad7抗體購自美國Santa cruz公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組：將50只20 g左右的雄性小鼠適應性喂養1周后隨機分為五組，每組10只，分別為空白對照組、模型組、丹酚酸B組、蒿屬香豆素低劑量組、蒿屬香豆素高劑量組。

1.3.2 造模：除空白對照組外，其余組飼喂MCD飼料。

1.3.3 給藥：造模后1周，蒿屬香豆素低劑量組給予30 mg/kg蒿屬香豆素灌胃(初始灌胃濃度為2 mg/ml)，香豆素高劑量組每日給予60 mg/kg灌胃(初始濃度為4 mg/ml)，丹酚酸B組給予10 mg/kg灌胃(初始濃度為0.67 mg/ml)，后期根據體重變化，調整濃度，空白對照組和模型組給予等體積(0.3 ml)的0.9%氯化鈉溶液灌胃，5周后取小鼠肝臟組織和血清進行實驗。

1.4 觀察指標

1.4.1 小鼠體重和肝重測定:稱取各組小鼠體重肝濕重，并計算肝臟指數。肝臟指數(%)=肝臟重量(g)/體重(g)×100%。

1.4.2 對肝臟組織進行病理檢查:NASH病理診斷標準采用NAFLD活動度積分(NAFLD Activity Score，NAS)進行評估[14]。

1.4.3 通過試劑盒檢測各組小鼠血清生化指標：按說明書步驟將各組血清樣本加入不同試劑中。通過紫外分光光度計或酶標儀檢測各指標的OD值。參照說明書公式計算血清天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)的含量。

1.4.4 比色法測肝臟組織MDA和SOD含量：取肝臟組織于勻漿器中，加入適量PBS溶液，制備5%或10%組織勻漿。按試劑盒說明書步驟加入樣本和試劑，檢測各管吸光度值，根據說明書公式計算各組MDA和SOD含量。

1.4.5 Western blot方法測小鼠肝臟組織液α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白、E鈣黏蛋白、波形蛋白、TGF-β1，Smad2/3、p-Smad2/3、Smad7表達：稱取適量肝臟組織，并用PBS沖洗剪碎后放入勻漿器中，加入5倍體積裂解液于組織中，快速勻漿。組織液吸出置于EP管中，14000 g離心15 min，取上清。BCA法檢測蛋白濃度，記錄數據。 上樣緩沖液中加入總體積1/20的β-巰基乙醇,蛋白與上樣緩沖液按4∶1混合；100 ℃水浴下煮沸15 min，瞬離后置于-20 ℃冰箱備用，若長期保存，應置于-70 ℃冰箱或液氮。 電泳、轉膜及顯影：10% SDS-PAGE垂直電泳后電轉移到PVDF膜，封閉1 h后，與特異性α-SMA、Ⅰ型膠原蛋白、E鈣黏蛋白、波形蛋白、TGF-β1、總Smad2/3、p-Smad2/3、Smad7一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗膜三次，每次15 min，加入相應二抗以結合一抗，37 ℃孵育1 h。洗膜后顯影并分析。

1.5 統計學方法 采用SPSS 22.0統計學軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間差異顯著性檢驗采用單因素方差分析及兩兩比較。P<0.05表示差異具有統計學意義。采用Image J計算蛋白灰度相對表達量。

2 結 果

2.1 各組小鼠一般狀況和體重、肝重等變化 空白對照組小鼠的生活狀態較好，食納正常，毛發的光澤正常；模型組小鼠隨造模時間延長，進食量開始減少，毛發的光澤度比空白對照組差，精神變得相對萎靡。而最終體重結果顯示，空白對照組小鼠增加，模型組減少。造模后的小鼠肝臟可見到顏色偏黃白，表現為脂肪變性，仔細觀察，部分模型組肝臟的表面出現少許結節，而空白對照組的小鼠肝臟表面光滑，無脂肪變性。各治療組小鼠肝臟表面無明顯的脂肪變性，顏色較空白對照組更深，尤其高劑量香豆素組，需考慮與肝臟代謝藥物可能有關(圖1)。

實驗開始時，各組小鼠體重基本一致，無統計學差異。飼養6周后，模型組和各治療組小鼠體重與空白對照組相比均顯著降低(P<0.01)，各治療組與模型組相比，體重增加(P<0.01)。模型組肝臟指數明顯上升，顯著高于對照組(P<0.01)，各治療組與模型組相比，肝臟指數明顯下降(P<0.01)。蒿屬香豆素高劑量、低劑量組之間差異有統計學意義(P<0.05)，但與丹酚酸B組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

A：空白對照組；B:模型組；C:丹酚酸B組；D:香豆素低劑量組；E:香豆素高劑量組圖1 各組小鼠肝臟外觀

表1 蒿屬香豆素對小鼠體重、肝重和肝臟指數的影響

2.2 各組小鼠肝臟病理變化 HE染色顯示，空白對照組肝臟組織形態結構正常，匯管區無炎癥細胞浸潤；無脂肪變性。模型組肝臟組織可見大面積脂肪樣變，炎癥細胞浸潤，肝細胞嚴重空泡化，竇周可見膠原纖維形成，肝小葉結構紊亂。丹酚酸B組、蒿屬香豆素高、低劑量組脂滴面積較模型組減少(圖2)。Masson染色可見空白對照組小鼠的肝臟組織無染色，沒有膠原沉積，模型組匯管區及匯管區周圍竇周纖維化，各治療組膠原沉積明顯較模型組減少(圖3)。

A：空白對照組；B:模型組；C:丹酚酸B組；D:香豆素低劑量組；E:香豆素高劑量組圖2 蒿屬香豆素對小鼠肝臟病理形態的影響(HE染色，×200)

A：空白對照組；B:模型組；C:丹酚酸B組；D:香豆素低劑量組；E:香豆素高劑量組圖3 蒿屬香豆素對小鼠肝臟病理形態的影響(Masson染色，×200)

2.3 小鼠肝組織NAS評分 見表2。NAS評分是非酒精性脂肪性肝病的診斷標準，小于3分排除NASH，大于4分即為NASH，介于兩者之間者可能是NASH。與空白對照組相比，模型組小鼠肝臟NAS 評分明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，各治療組小鼠NAS 評分明顯下降(P<0.01)，說明均能明顯改善MCD 誘導的NASH。高劑量蒿屬香豆素組較低劑量組評分降低(P<0.05)，比丹酚酸B組降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 各組小鼠肝臟組織NAS 評分(分)

2.4 蒿屬香豆素對小鼠生化指標的影響 見表3。模型組血清谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)較正常組小鼠升高，蒿屬香豆素及丹酚酸B組AST，ALT較模型組明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。各組間尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 蒿屬香豆素對脂肪性肝纖維小鼠生化指標的影響

2.5 蒿屬香豆素對小鼠肝臟MDA和SOD水平的影響 見表4。與空白對照組比較，模型組MDA的含量明顯升高(P<0.01)，SOD的含量顯著下降(P<0.01)。與模型組比較，各治療組MDA的含量明顯降低(P<0.01)。同時，各組的SOD的含量顯著增高(P<0.01)。與香豆素高劑量組相比，香豆素低劑量組MDA明顯增高，SOD水平降低(P<0.01)。而香豆素高劑量組與丹酚酸B組、低劑量組之間比較差異有統計學意義(P<0.01)。

表4 蒿屬香豆素對小鼠肝臟MDA和SOD水平的影響

2.6 各組纖維化、EMT指標及TGF-β/Smad通路蛋白表達的變化 見圖4、5(表5、6)。Western blot結果顯示，與空白對照組相比，模型組α-SMA、Ⅰ型膠原、波形蛋白的相對表達量明顯升高，E鈣黏蛋白的表達量下降，與模型組相比，丹酚酸B組和不同劑量蒿屬香豆素組能顯著降低α-SMA、Ⅰ型膠原、波形蛋白的表達量，增加E鈣黏蛋白的表達量。模型組TGF-β1、p-Smad2/3表達較空白對照組明顯升高(P<0.05)，而各治療組能顯著降低TGF-β1、p-Smad2/3蛋白的表達量，增加Smad7蛋白的表達量。各組與模型組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。對于纖維化指標(α-SMA、Ⅰ型膠原)，蒿屬香豆素高低劑量組存在統計學差異(P<0.05)，但其余指標各治療組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

A：空白對照組；B:模型組；C:丹酚酸B組；D:香豆素低劑量組；E:香豆素高劑量組圖4 蒿屬香豆素對各組纖維化、EMT指標影響

表5 蒿屬香豆素對各組纖維化、EMT指標影響

A：空白對照組；B:模型組；C:丹酚酸B組；D:香豆素低劑量組；E:香豆素高劑量組圖5 蒿屬香豆素對TGF-β/Smad通路蛋白表達的影響

表6 蒿屬香豆素對各組TGF-β1通路蛋白影響

3 討 論

非酒精性脂肪肝病隨著病情進展，易發展為肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌，隨著生活方式和飲食結構的改變，肥胖、糖尿病、代謝綜合征全球化流行，NAFLD的發病率也逐漸升高。NAFLD長期發展的結果必將導致非NASF。肝纖維化(Hepatic fibrosis,HF)是肝損傷持續存在、組織發生修復反應時因細胞外基質合成、降解與沉積不平衡而引起的病理過程，如果損傷因素長期存在，將增加發展為肝硬化甚至肝癌的可能性，嚴重威脅人類健康。在中醫學中，非酒精性脂肪肝雖然沒有統一病名，但根據其疾病特征和臨床表現可歸屬于“肥氣”“脅痛”“積聚”“痰痞”等范疇，非酒精性脂肪肝的發病與痰、濕、瘀、熱等病理因素密切相關，痰瘀互結為其基本病機，濕熱蘊結證為其常見證型。祛濕化瘀方是以祛濕化瘀治法為基礎擬定的臨床行之有效治療NAFLD 的常見中醫方劑，而茵陳就是其中重要的藥味組成[15]。

細胞因子、細胞外基質沉積及氧化等多個復雜因素均會造成組織、器官的纖維化。中藥及其主要成分對病理機制復雜的疾病可發揮綜合優勢，許多中藥有明顯抗氧化、治療NASH、抗纖維化等作用[16-18]?？寡趸瘎┰趯估w維化中有明顯效果，為中醫藥治療肝纖維化提供大量研究基礎。中藥組成通常較多，即使是單味藥包含的成分也通常有數十種，提取其中主要相應藥理學成分進行特異性治療，不僅能提高療效，還能降低不良反應，所以在本實驗主要研究中藥的主要提取成分。蒿屬香豆素是中藥茵陳蒿的主要成分，已有研究表明香豆素具有抗氧化等作用[19]。丹參中的主要提取物丹酚酸B，是目前公認的抑制肝纖維化的中藥成分之一，并且對非酒精性脂肪肝有明確的保護性作用[8,20]，本實驗中作為陽性對照。

本實驗通過構建NASH模型，給予蒿屬香豆素和丹酚酸B灌胃5周后，發現能有效抑制氧化、纖維化過程。本研究發現，與模型組相比，空白對照組小鼠和各治療組平均體重升高、肝臟濕重與小鼠體重的比率均明顯下降。各治療組較模型組相比，肝功能好轉，各組小鼠腎功能指標并沒有明顯差別，可見幾組治療藥物沒有明顯損傷小鼠的肝腎功能，且對肝臟有保護作用。HE染色發現，各治療組脂滴面積較模型組減少，明顯減輕了肝臟的脂質沉積。Masson染色可見模型組小鼠膠原沉積明顯，蒿屬香豆素和丹酚酸均能減少膠原沉積，高劑量蒿屬香豆素組較低劑量蒿屬香豆素、丹酚酸B組效果更明顯。

氧化應激是指多種因素造成的機體或細胞內活性氧(Reactiveoxygen species,ROS)過度產生，抗氧化防御功能減弱，嚴重破壞兩者之間的平衡，造成組織或細胞損傷的一種狀態。自由基于膜磷脂發生過氧化反應后產生MDA，可引起細胞膜結構和功能的紊亂，SOD作為生物體內重要的抗氧化酶，主要參與生物體內氧自由基的清除過程。蒿屬香豆素和丹酚酸均能有效減輕小鼠體內的氧化過程，提高小鼠的抗氧化能力，兩者相比較，高劑量的香豆素抗氧化作用更強，高劑量香豆素組抗氧化能力明顯高于低劑量組，這些與多年來國內外研究認為蒿屬香豆素具有較強抗氧化能力的結果相一致。α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白的表達能有效反應纖維化的水平，本研究發現，蒿屬香豆素和丹酚酸都能明顯減少其表達，同時高劑量的香豆素效果比低劑量更明顯，高劑量組與丹酚酸B之間抗纖維化差異并不明顯。

上皮-間質轉化(Epithelial-to-mesenchymal,EMT)在人體中發揮著重要的生物學功能，目前認為EMT 與多種器官纖維化聯系密切，如腎、肺、眼、肝等[21]。研究發現EMT有利于纖維化的早期診斷，通過藥物扭轉EMT過程為治療纖維化提供了新思路。ECM對EMT的發生和進展起著重要的作用，在EMT 過程中表型標志的改變，主要包括上皮細胞分子標志(如E鈣黏蛋白)的表達下降或喪失和一些間質細胞標志(如波形蛋白)的新表達或表達上升。本實驗中發現MCD飲食誘導的NASH活化過程中伴隨EMT的發生，蒿屬香豆素可以明顯減少波形蛋白，增加E鈣黏蛋白的表達，逆轉EMT的過程。

TGF-β1是常見的促纖維化因子，Smads是TGF-β信號傳導過程中最重要的胞內效應因子，它既是胞內信號分子，又有轉錄激活作用。TGF-β/Smad通路一直被認為是在許多臟器纖維化中起著重要作用[22-23]。本研究發現蒿屬香豆素能明顯減少TGF-β1的表達，各組組織總Smad2/3表達接近時，蒿屬香豆素明顯抑制p-Smad2/3的表達，同時增加了Smad7這一保護性蛋白的表達。

綜上所述，蒿屬香豆素通過抑制TGF-β1/Smad通路減輕肝臟炎癥，改善NASH，提高抗氧化能力，改善纖維化、逆轉EMT等方面有著一定作用。通過研究抗氧化劑對纖維化的作用，進一步探討氧化與纖維化之間相互關系，EMT的影響及相關分子機制，將為傳統中醫藥理論的現代研究奠定基礎。