生肌散抑制RIP1/RIP3/MLKL通路介導大鼠壓瘡形成實驗研究

郭 璐，趙兵剛，馮 婷，劉 沛

(空軍軍醫大學西京醫院急診科，陜西 西安 710032)

壓瘡又稱褥瘡、壓力性潰瘍，其發生主要是在壓力、摩擦力以及剪切力等物理力學復合作用下所引起的皮膚及皮下組織的局限性損傷，往往由于其久治不愈，最終合并嚴重感染導致惡病質、營養不良、終末期患者的死亡。組織壞死是Ⅲ期及以上壓瘡重要的病理學改變之一，程序性壞死是一種由死亡受體和配基啟動、依賴于受體相互作用蛋白活化介導的可調控性細胞壞死，其中受體相互作用蛋白激酶(Receptor-interacting protein，RIP)1/3是程序性壞死關鍵控制信號分子[1-2]，聯同下游的混合系激酶區域樣蛋白(Mixed-lineage kinase domain-like protein，MLKL)，共同決定細胞命運-凋亡、壞死或存活。中醫學認為，生肌散具有祛風去瘀，解毒生肌之功效，可用于瘡癤久潰，肌肉不生，久不收口[3-4]。然而現代醫學對生肌散的作用機制研究甚少。本研究通過制作SD大鼠Ⅲ期壓瘡模型，給予生肌散創面處理，對比各組大鼠壓瘡組織病理學、RIP1/RIP3/MLKL蛋白表達特征以及脂質過氧化產物丙二醛(Malondialdehyde，MDA)以及炎癥介質白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量變化，以期為生肌散治療壓瘡提供更多的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 SPF雄性SD大鼠60只，體重(250±30)g，購自空軍軍醫大學實驗動物中心[實驗動物使用許可證編號：SCXK(陜) 2019-001]，大鼠飼養于空軍軍醫大學藥理學實驗室動物室內，通風良好，環境安靜，溫度恒溫在25 ℃，動物實驗符合相關倫理要求并給予人道關懷(動物實驗倫理編號為：IACUC-200403)；生肌散購自北京同仁堂制藥廠，國藥準字 Z11020782。大鼠IL-1β、TNF-α 酶聯免疫吸附試劑盒(購自杭州聯科生物技術股份有限公司，批號分別為70-EK101B2，70-EK1822)；MDA檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(購自江蘇碧云天生物技術研究所，批號分別為S13245，P0010S，C0105)；山羊抗兔IgG二抗、兔抗大鼠RIP1、RIP3、MLKL抗體(購自美國Abcam公司，批號分別為ab34712，ab51475，ab47633)。

1.2 儀器與器械 儀器：聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置、凝膠成像系統購自美國Bio-rad公司；酶標儀購自美國Biotekiotek公司；微量移液器購自德國Eppendorf公司；恒溫箱(陜西西安環科實驗設備有限公司)。器械：經嚴格測量磁性磁鐵(直徑10 mm、厚2 mm、質量2.0 g、1600 Gs)、經高溫高壓滅菌的鐵片(直徑10 mm、厚1 mm、質量1.0 g)、無菌器械、電子稱。

1.3 動物模型的建立與分組 建立Ⅲ期大鼠壓瘡模型[6]，具體方法如下：使用異氟烷氣體麻醉大鼠，脫毛處理暴露實驗鼠左臀部周圍皮膚，備皮區域至少5 cm×5 cm大小，碘伏充分消毒手術區。在大鼠左側臀部做一深至肌肉層切口，鈍性分離肌層，埋入圓形鐵片(直徑10 mm，厚1 mm，質量1.0 g)，連續縫合切口，蘇醒后正常喂養。實驗開始時，在皮膚外，放置相同大小圓形磁鐵(直徑10 mm、厚2 mm、質量2.0 g、1600 Gs)，利用磁性對局部皮膚及肌肉產生壓力，造成局部組織缺血，每次缺血時間為2 h，間隔30 min，此為1個循環操作，進行30個循環操作(加壓缺血2 h，間隔30 min，再進行加壓)。建模成功標準：鐵片邊緣紅腫、糜爛，傷口滲液或滲血，受壓處皮膚變黑變硬，針刺皮膚未見出血，無痛覺，無筋膜、肌肉、骨骼等暴露。

按隨機數字表法將60只大鼠分為實驗動物，并隨機分為對照組、模型組、治療組各20只。模型組：制作Ⅲ期大鼠壓瘡模型，成模后，每日清創處理創面，創面外敷0.9%氯化鈉溶液紗布，2次/d，共7 d；對照組：僅同部位埋入磁鐵不予磁性加壓，其余處理同模型組；治療組：成模后，創面外敷生肌散2 mg，厚度為1 mm，然后用紗布覆蓋，2次/d，共7 d，其余處理同模型組。實驗結束后脊椎脫臼法處死大鼠取材，各組大鼠壓瘡皮膚組織提取總蛋白后置于-70 ℃冰箱保存備用。

1.4 組織病理學觀察 實驗結束后，冰上迅速切取受壓中心部位肌肉組織，10%甲醛溶液固定，梯度酒精脫水，二甲苯溶液浸泡透明，浸蠟包埋，使用切片機切成5 μm厚薄片，置入60 ℃烤箱中烘烤后脫蠟，進行蘇木素染色、伊紅染色，水洗后脫水，二甲苯溶液浸泡透明，封片，光學顯微鏡下觀察。

1.5 蛋白免疫印跡法比較各組大鼠壓瘡皮膚組織RIP1、RIP3、MLKL的變化 實驗結束后，提取組織蛋白，經用100 g/L 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉膜、室溫封閉后，分別加兔抗大鼠RIP1(1∶1000)、RIP3(1∶1000)、MLKL(1∶1000)，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入山羊抗兔二抗(1∶2500)孵育2 h，洗膜后，用增強化學發光法顯色、顯影，凝膠成像分析系統攝像分析，并以β-actin為內參。

1.6 試劑盒法測定各組大鼠壓瘡皮膚組織MDA含量 按照說明書，將MDA檢測工作液加入酶標板各孔，接著加入待測定樣本，以70 ℃高溫加熱，并整體震動待混合液徹底溶解。酶標儀(532 nm波長)進行數據讀取，利用工作曲線計算樣本蛋白的濃度，MDA含量用nmol/mg蛋白表示。

1.7 酶聯免疫吸附法測量IL-1β和TNF-α含量 取各組組織提取蛋白0.1 ml，同時加入陽性和陰性的對照標本，按照說明書配置標準品和檢測溶液，并按照操作步驟操作，加入終止液后使用酶標儀測定450 nm波長下的吸光度A。

1.8 統計學方法 采用SPSS 26.0統計學軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，兩組間與組內比較均采用單因素方差分析，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠壓瘡組織病變比較 60只大鼠在觀察期間耐受良好，各組大鼠均未出現死亡。肉眼觀察結果：模型組大鼠壓瘡皮膚可見鐵片邊緣壓紅，有明顯水腫帶，可有表皮的糜爛，局部有滲液或滲血，受壓部分皮膚顏色加深、變硬，針刺皮膚未見出血，無疼痛反應，未見筋膜、肌肉、骨骼等暴露。治療組創面病變較模型組明顯好轉。對照組大鼠皮膚組織未見明顯異常(圖1)。

光鏡觀察結果：模型組大鼠壓瘡皮膚組織表面鱗狀上皮細胞損傷、缺失，真皮層菲薄，有大量淋巴細胞和中心粒細胞浸潤，間質水腫明顯，病灶深達肌肉層，肌纖維萎縮。治療組大鼠壓瘡皮膚組織病變較模型組好轉，表皮和真皮層損傷斷裂、壞死范圍明顯減少，僅可見少量中性粒細胞浸潤。對照組大鼠皮膚組織未見明顯異常(圖1)。

圖1 各組大鼠壓瘡皮膚組織病變觀察結果(HE染色，×200)

2.2 各組大鼠壓瘡組織中RIP1、RIP3和MLKL表達比較 見表1。與對照組比較，模型組RIP1、RIP3和MLKL表達均明顯升高，差異有統計學意義(均P<0.05)；與模型組比較，治療組RIP1、RIP3和MLKL表達均明顯減少，差異有統計學意義(圖2)。

表1 各組大鼠壓瘡組織中RIP1、RIP3和MLKL表達比較

圖2 各組大鼠壓瘡組織中RIP1、RIP3和MLKL表達比較

2.3 各組大鼠壓瘡組織MDA含量比較 見表2。與對照組比較，模型組MDA含量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，治療組MDA含量明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠壓瘡組織MDA含量比較(nmol/mg)

2.4 各組大鼠壓瘡組織中IL-1β和TNF-α含量比較 見表3。與對照組比較，模型組IL-1β和TNF-α含量均明顯升高，差異有統計學意義(均P<0.05)；與模型組比較，治療組IL-1β和TNF-α含量均明顯減少，差異有統計學意義(均P<0.05)。

表3 各組大鼠壓瘡組織中IL-1β和TNF-α含量比較(pg/mg)

3 討 論

由于Ⅲ期壓瘡屬于開放創面，常常引起嚴重感染，導致創面難以愈合，極大影響患者預后。各大醫院均成立專門針對壓瘡防治的多學科協作小組，旨在提高壓瘡的預防，加速創面愈合，尤其針對Ⅲ期壓瘡的防治，縮短患者平均住院日，減少醫療費用，是臨床中的重要任務[5]。

目前制作動物壓瘡模型裝置主要分為非侵入性裝置與侵入性裝置兩大類[6]。非侵入性裝置主要有以下兩種：體外無創壓力裝置，但使用該裝置時需要實驗動物持續處于麻醉狀態，而使用麻醉藥物導致實驗動物全身肌肉松弛，會導致最終的實驗結果的偏移；另外一種是非侵入性磁力加壓裝置，利用兩個互相吸引的圓形磁鐵之間夾著受試部位，磁力加壓形成皮膚損害，然而這種造模方法并不能制備深部組織損傷的壓瘡模型，因此不適用于Ⅲ期及以上壓瘡的基礎研究。侵入性方法主要有脊髓手術法與侵入性磁力壓迫法，其中脊髓手術操作復雜，造模周期較長，動物長期的營養狀態對最終實驗結果影響較大，并不適合本研究使用。侵入性磁力加壓法是將無菌圓形鐵片置入皮下，同時外面放置磁鐵，然后反復施加和去除磁鐵，引起皮膚組織的損傷。該方法造模穩定，可控制壓瘡分期。造模以后，實驗大鼠在觀察期間耐受良好，各組均未出現死亡，與其他研究者所得結果類似[7]。

美國國家壓瘡指導專家組關于Ⅲ期壓瘡的定義具體如下：全層皮膚損傷，皮下脂肪組織暴露，但未見骨骼肌腱或肌肉，可能存在壞死組織的潛行[8]。但目前研究認為，程序性壞死是一種由腫瘤壞死因子受體(Pattern recognition receptor，PRR)等死亡受體和配基啟動、依賴于受體相互作用蛋白活化介導的可調控性細胞壞死[9-11]。有別于細胞凋亡的發生機制，程序性壞死通常發生于組織細胞能量代謝嚴重障礙的情況下，此時ATP合成生成嚴重不足，難以維持凋亡通路關鍵信號分子Caspase活性，凋亡通路因而被抑制，細胞壞死通路被激活[12-14]。RIP1和RIP3均為程序性壞死通路中的關鍵啟動信號分子，聯同下游的MLKL，共同決定生命細胞凋亡、壞死或存活[15]。本實驗里我們通過制作Ⅲ期SD大鼠壓瘡模型，發現模型組大鼠壓瘡組織RIP1、RIP3、MLKL通路關鍵信號分子蛋白表達明顯升高，提示RIP1/RIP3/MLKL 通路介導的程序性細胞壞死在大鼠壓瘡形成中可能起重要的作用。

壓瘡在傳統中醫學中屬“瘡瘍”范疇，由于人體氣血兩虛，若長期臥床，下垂部位局部受壓，加重局部的氣血瘀滯，局部組織缺乏氣血的滋養，出現皮膚潰瘍，因此祛腐生肌、祛瘀補虛是治療壓瘡的重要原則[4]。生肌散具有祛風去瘀，解毒生肌之功效，可用于瘡癤久潰，肌肉不生，久不收口，在各種瘡瘍的治療上均有明顯療效。研究結果顯示，治療組創面病變較模型組明顯好轉，且與模型組比較，RIP1、RIP3和MLKL表達均明顯減少，差異有統計學意義，顯示生肌散可能通過抑制RIP1/RIP3/MLKL 通路介導的程序性細胞壞死，促進大鼠壓瘡創面的愈合。

RIP1與TNF-α受體結合被直接激活，可根據細胞能量狀況，選擇激發細胞凋亡通路或激活細胞壞死通路，在組織細胞能量代謝嚴重障礙的情況下，細胞凋亡通路受到抑制,通過 RIP1/RIP3/MLKL 通道激活程序性壞死[16]。研究者發現，壓瘡模型大鼠血清TNF-α濃度明顯升高。受損傷的肌肉細胞可釋放多種炎癥介質，主要以IL-1β和TNF-α為主，這些炎癥介質可引起細胞間黏附因子-1等黏附分子表達上調，促進中性粒細胞募集、附壁、游走等過程，并釋放相應的趨化因子，引起一系列炎癥反應，從而加重組織水腫的發生[17-18]。局部IL-1β積聚，可刺激炎癥細胞產生大量活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，其氧化應激效應可對細胞脂質雙層生物膜產生損傷[17]。脂質過氧化過程中可產生MDA，檢測組織中MDA含量是評估細胞生物膜脂質過氧化損傷的重要手段[19-20]。我們的研究顯示模型組大鼠壓瘡組織中MDA含量、IL-1β和TNF-α含量均明顯增高，且與模型組比較，治療組MDA含量、IL-1β和TNF-α含量均明顯減少，差異均有統計學意義。由此我們推斷，大鼠壓瘡發生發展過程中，組織細胞內所產生IL-1β和TNF-α等炎癥因子，引起的一系列應激反應導致的生物膜脂質過氧化可能與細胞程序性壞死密切相關，但經生肌散處理大鼠壓瘡創面后，可減少組織細胞中IL-1β和TNF-α產生，減少脂質過氧化，減少組織損傷，然而具體損傷機制仍有待后續進一步的研究發現。

綜上所述，本研究組通過制作SD大鼠Ⅲ期壓瘡模型，生肌散處理創面，比較各組大鼠壓瘡皮膚組織病理學改變、RIP1/RIP3/MLKL通路關鍵信號分子蛋白表達、脂質過氧化產物丙二醛、IL-1β和TNF-α含量的差異，結果發現RIP1/RIP3/MLKL通路在壓瘡形成中發揮重要作用，生肌散可抑制RIP1/RIP3/MLKL 通路介導的程序性細胞壞死，減少組織中IL-1β和TNF-α產生，減少脂質過氧化，減少組織損傷，促進大鼠壓瘡創面的愈合。