益氣活血方對乳腺癌MCF-7細胞系增殖侵襲能力及miR-100表達水平影響的研究

馮秀梅 ，馬 蘭，羅玉群 ，李海濱，馬紋蕊

(1.青海省中醫院乳腺科，青海 西寧 810000；2.青海大學醫學院,青海 西寧 810008)

現階段，乳腺癌的治療多采用以手術為主的綜合化療，輔助治療如放化療、內分泌治療和生物靶向治療在其中亦扮演著至關重要的角色[1]。同時，隨著健康篩查的普及，乳腺癌的發生率和病死率狀況得到改善[2]。然而，即使在診療水平不斷完善的今天，乳腺癌患者的確診率、術后復發轉移率仍然居高不下[3]。尋找合理而有效的乳腺癌治療策略和藥物一直是醫學界的重點問題。中醫藥治療腫瘤已有悠久歷史，且成效頗為顯著，具有改善患者生存質量、降低轉移復發率、延長患者生存期等優勢[4-5]，已成為手術、放化療、基因療法外的重要治療手段。

氣機不暢則氣郁血瘀。在中醫學上，乳腺癌的發生與氣血失調、瘀血痰飲密切相關[6]。此外，microRNA表達譜的變化已被證實與腫瘤的發生發展密切相關[7]。同時，既往研究已證實microRNA-100(miR-100)可直接負向調控乳腺癌細胞增殖能力[8]。鑒于此，本研究探究益氣活血方對乳腺癌MCF-7細胞系增殖侵襲能力及miR-100表達水平的影響，以期為乳腺癌篩查提供良好生物學標志物，并為該腫瘤的中醫治療提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株 MCF-7乳腺癌細胞系(購自中國科學院上海細胞研究所)以含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養基培養，置于36 ℃的飽和濕度恒溫孵育箱中培養。取生長良好的細胞經0.25%胰蛋白酶消化后，進行后續試驗。

1.2 試驗試劑、儀器及藥物 RPMI-1640培養基(Hyclone公司，USA)；DMEM高糖培養基(Hyclone公司，USA)；0.25%胰蛋白酶和胎牛血清(FBS；Gibco公司，USA)；磷酸鹽緩沖液(PBS；Hyclone公司，USA)；Tap Man MicroRNA熒光定量PCR檢測試劑盒(Applied Biosystems公司，USA)；二甲基亞砜(DMSO；國藥集團，中國)；噻唑藍(MTT；Sigma公司，USA)；培養板及離心管(Corning公司，USA)；高速恒溫離心機(Thermo Forma公司，USA)；全自動酶標儀(BioTek公司，USA)；倒置顯微鏡(Olympus，日本)。益氣活血方配方由本院制劑部提供，該藥方組成包括黃芪、薏仁、茯苓、白術、紅花、當歸等；以上藥物以煎煮方式濃縮至1.4 g/ml，制備后置于4 ℃冰箱保存。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及細胞處理：取對數生長期的MCF-7乳腺癌細胞系，采用含10% FBS培養液進行培養。將上述制備藥物采用培養液稀釋為20、40和80 mg/L，設置高、中和低濃度分別培養細胞，并設置對照組(無藥物的相同培養液)。

1.3.2 qRT-PCR檢測miR-100的表達水平：取對數生長期的MCF-7乳腺癌細胞系，依據上述方法分組處理細胞。吸取細胞培養基，以1.0 ml TRizol吹打細胞，室溫裂解2～3 min。離心棄上清，計算RNA濃度和波長260 nm和280 nm處吸光度值。按照Tap Man Micro RNA熒光定量PCR檢測試劑盒逆轉錄后，應用qRT-PCR進行定量檢測；以U6為內參。以相對定量法進行分析，反應條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共計40個循環。本實驗所用引物均由Applied Biosystems公司合成。反應結束后計算CT值，應用2-△△CT法計算miR-100相對表達量。

1.3.3 MTT法檢測乳腺癌細胞增殖情況：應用MTT法檢測乳腺癌細胞系MCF-7的細胞增殖情況并對比組間差異。依據商法將益氣活血方濃縮液用DMSO溶液溶解并稀釋，取對數生長期MCF-7細胞置于培養液中培養，調整細胞濃度，接種于96孔板，以20、40和80 mg/L濃度的益氣活血配方溶液培養細胞。分別培養24 h、48 h和72 h后，每孔避光加入20 μl 0.5%MTT溶液，孵育4 h后棄去培養液，每孔加入DMSO溶液(150 μl)。于波長490 nm處采用酶聯免疫吸附儀檢測各孔吸光度值(OD)。以不含藥方溶液的完全培養基培養細胞為對照。采用MTT法檢測MCF-7細胞增殖抑制率。MCF-7細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.3.4 Transwell小室法檢測乳腺癌細胞侵襲情況：應用Transwell小室法檢測乳腺癌細胞系MCF-7的細胞增殖情況并對比組間差異。同法處理細胞，以20、40、80 mg/L濃度的益氣活血配方溶液培養細胞為高、中和低濃度實驗組，以不含藥物的相同培養液培養細胞為對照組。取Transwell小室加入Matrigel膠，接種細胞前加入50 μl含體積分數1%FBS的培養液，37 ℃下培養30 min，再次應用含1%FBS的培養液重懸細胞，調整細胞濃度至1×105/ml，接種于上室；下室加入600 μl DMEM培養液，繼續培養24 h。PBS清洗上室后拭去未侵襲細胞。細胞侵襲抑制率計算公式如下所示：MCF-7細胞侵襲抑制率=(1-實驗組細胞侵襲數/對照組細胞侵襲數)×100%。

1.3.5 Western blot法檢測增殖侵襲相關蛋白：取對數生長期的MCF-7乳腺癌細胞系，依據上述方法分組處理細胞后，收集各組細胞經RIPA裂解液裂解細胞，離心取上清。采用BCA法檢測蛋白質含量。取蛋白樣本經10% SDS-PAGE電泳，濕轉法轉膜后將PVDF膜應用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h。隨后，將PVDF膜與細胞增殖相關蛋白特異性周期蛋白D1(Cyclin D1)和侵襲相關蛋白基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)一抗孵育過夜(4 ℃)；TBST洗滌3次后，常溫下與HRP標記二抗孵育1 h。ECL法顯影后采用凝膠成像儀掃描膠片并保存和分析結果。

1.4 統計學方法 采用SPSS 20.0 統計學軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，兩組間樣本數據比較采用t檢驗；多組間樣本數據比采用卡方檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同濃度益氣活血方對乳腺癌MCF-7細胞miR-100表達水平的影響 PCR檢測對照組miR-100表達水平為(1.00±0.05)；實驗組miR-100表達水平升高，其中低、中和高濃度組分別為(1.38±0.05)、(1.54±0.05)和(1.71±0.07)，與對照組相比差異有統計學意義(均P<0.05)。同時，在實驗組內，與較低濃度組相比，較高濃度組miR-100表達水平亦呈上升趨勢，實驗組間差異亦存在統計學差異(均P<0.05)，提示miR-100表達水平在實驗組間升高趨勢呈劑量依賴性(圖1)。

圖1 PCR實驗檢測不同濃度益氣活血方對乳腺癌MCF-7細胞miR-100表達水平的影響

2.2 不同濃度益氣活血方對乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響 見表1。根據MTT實驗檢測，組間比較結果顯示：在培養24 h時，各組間細胞增殖抑制率差異無統計學意義(均P>0.05)；而在培養48 h和72 h時，與對照組相比，實驗組細胞增殖抑制率明顯升高，差異具有統計學意義(均P<0.05)，提示細胞增殖能力下降；同時，與較低濃度組相比，較高濃度組細胞增殖抑制率亦呈上升趨勢，實驗組間比較差異有統計學意義(均P<0.05)，提示細胞增殖能力在實驗組受抑制，且呈劑量依賴性。

表1 不同濃度益氣活血方對乳腺癌MCF-7細胞增殖抑制率的影響

2.3 不同濃度益氣活血方對乳腺癌MCF-7細胞侵襲的影響 見表2。依據Transwell小室法檢測結果，益氣活血方對乳腺癌MCF-7細胞侵襲具有抑制作用，具體表現為與對照組相比，實驗組細胞侵襲抑制率明顯升高，差異具有統計學意義(均P< 0.05)，提示細胞侵襲能力的下降；同時，與較低濃度組相比，較高濃度組細胞侵襲抑制率亦呈上升趨勢，實驗組間比較亦存在統計學差異(均P<0.05)，提示細胞侵襲能力在實驗組受抑制，且呈劑量依賴性。

表2 不同濃度益氣活血方對乳腺癌MCF-7細胞侵襲抑制率的影響

2.4 不同濃度益氣活血方對乳腺癌MCF-7細胞增殖相關蛋白Cyclin D1和侵襲相關蛋白MMP-9表達水平的影響 見表3。不同濃度益氣活血方對乳腺癌MCF-7細胞增殖相關蛋白Cyclin D1和侵襲相關蛋白MMP-9表達水平Western blot蛋白檢測結果提示：與對照組相比，實驗組Cyclin D1和MMP-9蛋白表達水平明顯降低，差異具有統計學意義(均P<0.05)；同時，在實驗組內，與較低濃度組相比，較高濃度組Cyclin D1和MMP-9蛋白表達水平亦呈下降趨勢，實驗組間比較差異有統計學意義(均P<0.05)，提示Cyclin D1和MMP-9蛋白表達水平在實驗組間降低趨勢呈劑量依賴性。

表3 不同濃度益氣活血方對乳腺癌MCF-7細胞增殖相關蛋白Cyclin D1和侵襲相關蛋白MMP-9表達水平的影響

3 討 論

眾所周知，細胞增殖侵襲等是惡性腫瘤發生發展的基本特征，亦是患者病情轉移和復發的主要原因[9]。近年來，乳腺癌的發病率逐年上升[10-11]，位居女性腫瘤發病率首位，其病死率不容樂觀。現階段的乳腺癌綜合治療手段眾多，如手術、以順鉑為主的化療、放療等。然而，上述療法亦不同程度存在癌細胞轉移、藥物耐藥性、不良反應等。基于此，以中醫藥為輔的治療方案一直是醫學界的研究熱點。其在減輕化療藥物不良反應、增強抑癌效果、提高患者耐受性和生存質量等方面作用顯著[12-13]。

在中醫學中，“虛瘀致癌”理論已逐漸獲得認同[14]。正氣不足、氣血運行受擾，導致瘀血形成；同時，受外邪侵襲，轉移微環境導致腫瘤復發轉移風險更高[15]。乳腺癌在中醫學中與“乳巖”“乳癰”“乳痛”和“乳痃”等相對應。古書有記載：“內寒之氣，經虛血結”“憂怒郁悶，昕夕積累，脾氣消阻，肝氣橫逆，遂成隱核”“乳巖初結核隱疼，肝脾兩損氣郁凝”[16-17]。乳腺癌的病機與肝、腎、脾、胃等器官均存在關聯。肝氣不舒、肝脾不和、氣滯血瘀、郁結傷脾、瘀毒蘊結，經絡受阻，最終導致疾病的發生發展[18]。因此，“益氣活血法”不失為一種治療乳腺癌的良方。

本研究選用益氣活血方由黃芪、薏仁、茯苓、白術、紅花、當歸等組成。重用補氣血的黃芪、薏仁、茯苓、白術、當歸；活血化瘀的紅花和當歸；另外，茯苓、白術亦可健脾益氣，黃芪、白術可補氣健脾固表，最終發揮益氣扶正、補氣健脾、生津補氣、除痰祛濕等功效，進而益氣、除濕、和中、補血、健脾[19-20]。本研究取對數生長期的MCF-7乳腺癌細胞系，設置益氣活血方高、中和低濃度實驗組，并設置對照組。結果顯示，與無藥物處理對照組相比，實驗組miR-100表達水平升高、細胞增殖抑制率提升、細胞侵襲抑制率升高，且Cyclin D1和MMP-9蛋白表達水平明顯降低；同時實驗組內與較低濃度組相比，較高濃度組miR-100表達水平升高、細胞增殖抑制率和侵襲抑制率升高，以及且Cyclin D1和MMP-9蛋白表達水平下降趨勢呈劑量依賴性。上述結果提示，益氣活血方可有助于提高具有抑癌作用的miR-100表達水平，并降低細胞增殖相關蛋白Cyclin D1和侵襲相關蛋白MMP-9表達水平，進而抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲能力。

綜上所述，本研究提示益氣活血方可提高miR-100表達水平、降低Cyclin D1和MMP-9表達水平、進而發揮抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲的功能。本研究提示該組方可有效調節腫瘤增殖侵襲過程，進而抑制癌細胞轉移，為益氣活血方治療乳腺癌提供了思路。