丹蔞片對載脂蛋白E基因敲除小鼠血脂及AMPK/SREBP通路的影響

劉小微,李娟娥,姜小帆,侯杰軍,南曉強,李 靜,劉沈楠,張洪宇,雷 鵬,雷忠義

(1.陜西省人民醫(yī)院,陜西 西安 710068；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,陜西 咸陽 712021；3.陜西省中醫(yī)醫(yī)院,陜西 西安 710003)

高脂血癥(Hyperlipemia，HLP)是由于體內(nèi)脂肪代謝異常所引起的血清中脂蛋白含量超出正常水平范圍的代謝性疾病。據(jù)調(diào)查研究顯示[1]：中國成人血脂異常的發(fā)病率已經(jīng)從2002年的18.60%上升至2012年40.40%，出現(xiàn)急速上漲趨勢，高脂血癥是導(dǎo)致動脈粥樣硬化性疾病的主要病因之一。近期研究證明高脂血癥是遺傳和環(huán)境等危險因素共同作用的結(jié)果,屬于多基因性疾病[2]。

中醫(yī)藥治療高脂血癥的實驗研究、抑制延緩動脈粥樣硬化及冠心病的發(fā)生發(fā)展是多環(huán)節(jié)、多方位、多靶點的綜合作用[3-4]。雷忠義國醫(yī)大師在長期的臨床實踐中認(rèn)識到痰瘀互結(jié)在冠心病的發(fā)病中是獨立存在的，且貫穿于疾病整個病程中。隨后經(jīng)過大量的臨床調(diào)查及實驗研究，最終確立了冠心病痰瘀互結(jié)證型的存在，并研發(fā)了該證型目前的唯一用藥——丹蔞片。該藥由瓜蔞皮、薤白、丹參、黃芪、葛根、川芎、赤芍、澤瀉、骨碎補、郁金等10味藥物組成，具有燥濕祛痰、活血化瘀的功效[5-7]。方中瓜蔞皮與薤白為君藥，起理氣化痰寬胸的作用；丹參、赤芍、葛根、川芎四藥合用共奏活血通絡(luò)，化瘀止痛之效，黃芪補氣行血，澤瀉健脾利水；骨碎補補腎活血，體現(xiàn)了從腎治心的原則，郁金、川芎可使氣血運行通暢，全方組合體現(xiàn)了痰瘀同治的原則，其治療冠心病療效確切[8-11]。在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)丹蔞片在治療冠心病的同時可以降低血脂水平，但是作用機制尚不完全明確。因此，本實驗通過復(fù)制載脂蛋白E(Apolipoprotein E，APoE)小鼠高脂血癥模型，采用現(xiàn)代全自動生化分析儀分析丹蔞片對血脂以及肝功指標(biāo)變化的影響，采用蛋白免疫印跡法和熒光定量PCR法對肝臟中脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白以及基因進行測定，探究丹蔞片的降脂作用以及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級6周齡APoE-/-雄性小鼠48只，體重18～22 g，由北京維通利華公司提供[許可證號:SCXK(京)2016-0006],基因遺傳背景為C57BL/6。飼養(yǎng)于陜西省人民醫(yī)院中心實驗室SPF級動物房內(nèi)，飼養(yǎng)環(huán)境為22～25 ℃，濕度為50%～60%。

1.2 藥 物 丹蔞片超微粉由吉林康乃爾藥業(yè)提供，國藥準(zhǔn)字Z20050244；瑞舒伐他汀鈣片：阿斯利康藥業(yè)，國藥準(zhǔn)字 H20160547。

1.3 試劑及儀器 抗體AMPK、SREBP-1、HMGCR均購于英國Abcam公司，抗體β-actin購于康為世紀(jì)公司，低溫高速離心機(長沙英泰儀器公司)，-80 ℃冰箱(美國賽默飛世爾公司)，電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽(美國Bio-Rad公司)，RNA提取試劑盒產(chǎn)自康為世紀(jì)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒產(chǎn)自Biosharp，熒光定量PCR試劑盒產(chǎn)自Biosharp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成提供，見表1。

表1 PCR引物序列

1.4 分組及模型的建立 所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為六組，空白對照組、模型組、瑞舒伐他汀鈣片組、聯(lián)合用藥組、丹蔞片高劑量組、丹蔞片低劑量組，每組8只。空白對照組予以普通飼料喂養(yǎng)，其余各組予以高脂飼料喂養(yǎng)6周以建立高脂血癥模型。6周后檢測血脂發(fā)現(xiàn)與空白對照組相比，造模組血脂明顯升高，提示造模成功。

1.5 藥物治療 根據(jù)成人每日口服藥物劑量折算小鼠服藥劑量，折算系數(shù)為12.33。經(jīng)查閱相關(guān)文獻，瑞舒伐他汀成人每日用量為10 mg，根據(jù)換算公式得出小鼠劑量大約為2 mg/kg；成人每日需服用丹蔞片4.5 g，換算成小鼠用藥濃度為1 g/kg作為低劑量組，該濃度的4倍作為高劑量組，他汀臨床劑量加上丹蔞片臨床劑量作為聯(lián)合用藥組劑量。由此得出各組劑量分別為：瑞舒伐他汀組2 mg/(kg·d)、聯(lián)合用藥組[瑞舒伐他汀鈣片2 mg/(kg·d)+丹蔞片1 g/(kg·d)]、丹蔞片低劑量組1 g/(kg·d)、丹蔞片高劑量組4 g/(kg·d)。按上述劑量將各組藥物用蒸餾水制備成混懸液，每日灌胃1次 ，每次約3 ml。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 小鼠體重記錄：一般情況每兩周稱量小鼠體重并記錄，并觀察小鼠活動度、精神狀態(tài)以及皮毛光澤度。

1.6.2 血脂相關(guān)指標(biāo)分析：生化指標(biāo)的檢測實驗結(jié)束后，小鼠禁食不禁水過夜處理，摘除眼球取血，靜置30 min后，以3000 r/min的速度進行離心10 min，提取上層血清，使用全自動生化儀檢測血脂四項(TG、TC、LDL-C、HDL-C)及肝功能(AST、ALT)的含量。

1.6.3 通路相關(guān)分子蛋白水平測定：肝臟組織中AMPK信號通路相關(guān)分子蛋白表達水平采用Western blot法檢測。取100 mg左右的小鼠肝臟組織，經(jīng)蒸餾水漂洗2～3次后置于勻漿器內(nèi)剪成碎塊，加入1 ml的裂解液(含有10 μl蛋白酶抑制劑和10 μl磷酸酶抑制劑)繼續(xù)絞碎組織；直到無明顯組織塊后，將其在冰上孵育30 min待其徹底裂解；4 ℃條件下10000 g轉(zhuǎn)速進行離心10 min，提取蛋白上清液，并用酶標(biāo)儀測定蛋白濃度。制備好的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后在200 mA電流下將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜完成后的PVDF膜在含5%脫脂奶粉的封閉液中，室溫孵育1 h封閉，然后孵育一抗4 ℃過夜，之后PBST洗滌數(shù)次，每次5～10 min；室溫孵育二抗1 h，PBST洗滌數(shù)次，每次5～10 min。化學(xué)發(fā)光滴加ECL工作液2 min后，去盡殘液，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分析數(shù)據(jù)。確定樣品中 AMPK、SREBP-1、HMGCR表達的相對含量。

1.6.4 通路相關(guān)分子基因水平測定：肝臟組織中AMPK信號通路相關(guān)分子基因表達水平采用RTq-PCR法檢測。采用 Trizol 試劑從肝臟中提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系為20 μl：SYBP Green qPCR Mix 10 μl，上下游引物各1 μl，cDNA模板1 μl，無酶水7 μl，反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。PCR儀測定Ct值(擴增量達到閾值的循環(huán)數(shù))。待測樣本mRNA相對表達量的計算采用以下公式：△Ct=(待測樣本mRNA Ct值)-(該樣本內(nèi)參 mRNA Ct值)，-△△Ct=-[待測組(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)-參照組(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)]，待測樣本mRNA相對表達量=2-△△Ct。

2 結(jié) 果

2.1 高脂血癥小鼠一般情況 見表2。實驗進行期間模型組小鼠體重增長迅速，體型肥大，皮毛雜亂且無光澤，精神不佳；空白對照組小鼠則精神佳，皮毛順滑有光澤，開始給藥治療后，各治療組小鼠體重雖然仍在增長，但是速度減緩，精神好轉(zhuǎn)。造模6周即給藥0周時，與空白對照組相比，其他五組小鼠體重明顯增加，雖然數(shù)據(jù)無統(tǒng)計學(xué)差異，但仍說明長期高脂飲食可以增加小鼠體重。給藥6周后，與模型組比較，聯(lián)合用藥組和丹蔞片高劑量組小鼠體重明顯降低，且具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，瑞舒伐他汀鈣片組及丹蔞片低劑量組小鼠體重也降低，但無統(tǒng)計學(xué)差異。說明丹蔞片呈劑量依賴性降低高脂血癥小鼠體重。

表2 丹蔞片對小鼠體重的影響(g)

2.2 高脂血癥小鼠血脂變化 見表3。與空白對照組相比，模型組的TC，TG，LDL-C含量顯著增加，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001)，HDL-C含量顯著降低，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001)；與模型組相比，各用藥組小鼠血清TC、LDL-C含量均降低(P<0.001)，瑞舒伐他汀鈣片組小鼠血清TG含量顯著下降(P<0.01),聯(lián)合用藥組小鼠血清TG含量極顯著降低(P<0.001),丹蔞片低劑量組、高劑量組小鼠血清TG含量顯著降低(P<0.05)；瑞舒伐他汀鈣片組小鼠血清HDL含量顯著升高(P<0.05),聯(lián)合用藥組小鼠血清HDL含量極顯著升高(P<0.01)，丹蔞片低劑量組、高劑量組小鼠血清HDL含量顯著升高(P<0.05)。組間比較結(jié)果顯示，各用藥組之間降低血清TG含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義；聯(lián)合用藥組小鼠血清HDL含量較丹蔞片低劑量組顯著升高(P<0.05)；聯(lián)合用藥組小鼠血清TC含量較其他三組小鼠降低(P<0.001)，丹蔞片低劑量組血清TC含量顯著升高(P<0.01)，丹蔞片高劑量組小鼠血清TC含量顯著升高(P<0.05)；瑞舒伐他汀鈣片組小鼠較丹蔞片高劑量組小鼠的血清TC含量下降(P<0.05)，較丹蔞片低劑量小鼠的血清TC含量顯著下降(P<0.01)；丹蔞片高劑量組小鼠血清TC含量較低劑量組降低(P<0.05)；聯(lián)合用藥組小鼠血清LDL含量較瑞舒伐他汀鈣片組、丹蔞片低劑量組、丹蔞片高劑量組均顯著降低(P<0.01)，與丹蔞片低劑量組比較，瑞舒伐他汀鈣片組、丹蔞片高劑量組小鼠血清LDL含量顯著降低(P<0.05)。說明丹蔞片具有降低血脂水平的作用，且可以和瑞舒伐他汀鈣片起協(xié)同作用。

表3 各組小鼠血脂指標(biāo)水平比較(mmol/L)

2.3 高脂血癥小鼠肝功能變化 見表4。與空白對照組相比，模型組血清小鼠AST、ALT含量極顯著升高，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001)；與模型組相比，瑞舒伐他汀鈣片組、丹蔞片低劑量組ALT、AST含量顯著降低(P<0.05)，聯(lián)合用藥組、丹蔞片高劑量組ALT含量顯著降低(P<0.001)；AST含量顯著降低(P<0.01)，說明丹蔞片可以顯著減低高脂血癥小鼠肝臟中ALT、AST的含量，具有保護肝臟的作用，且與劑量成一定的正比。

表4 丹蔞片對高脂血癥小鼠肝功的影響(mmol/L)

2.4 丹蔞片對高脂血癥小鼠AMPK信號通路相關(guān)基因蛋白表達的影響 見圖1(表5)。與空白對照組相比，模型組小鼠肝臟中AMPK的蛋白表達量顯著下降(P<0.05)，SREBP-1、HMGCR蛋白的表達量顯著上升(P<0.01)，與模型組相比，聯(lián)合用藥組AMPK蛋白含量顯著上升(P<0.05)，瑞舒伐他汀鈣片組、丹蔞片組AMPK蛋白含量上升，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。瑞舒伐他汀鈣片組、丹蔞片低劑量組SREBP-1蛋白含量顯著降低(P<0.05)，聯(lián)合用藥組、丹蔞片高劑量組SREBP-1蛋白含量顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，瑞舒伐他汀鈣片組、聯(lián)合用藥組、丹蔞片低劑量組、丹蔞片高劑量組HMGCR蛋白含量均顯著降低(P<0.05)。綜上所述，丹蔞片可以通過抑制脂肪代謝相關(guān)因子SREBP-1、HMGCR蛋白水平的表達，起到降低血脂的作用。

表5 丹蔞片對AMPK信號通路相關(guān)基因蛋白表達的影響

圖1 高脂血癥小鼠肝臟相關(guān)基因蛋白水平免疫印跡條帶圖

2.5 丹蔞片對高脂血癥小鼠AMPK信號通路相關(guān)基因mRNA表達的影響 見表6。與空白對照組相比，模型組小鼠肝臟中AMPK mRNA表達量顯著下降(P<0.001),與模型組比較，聯(lián)合用藥組、丹蔞片高劑量組AMPK mRNA 表達量均上升(P<0.05)；瑞舒伐他汀鈣片組和丹蔞片低劑量組中AMPK mRNA表達量上升但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與空白對照組相比，模型組SREBP mRNA的表達量顯著上升(P<0.05)，與模型組相比，各用藥組SREBP mRNA表達量顯著降低(P<0.05)。與空白對照組相比，模型組HMGCR mRNA的表達量顯著上升(P<0.001)，與模型組相比，聯(lián)合用藥組、瑞舒伐他汀鈣片組和丹蔞片高劑量組HMGCR mRNA表達量均降低(P<0.05)，丹蔞片低劑量組HMGCR mRNA表達量降低但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明丹蔞片可以通過抑制脂肪代謝相關(guān)因子SREBP-1、HMGCR mRNA水平的表達，起到降低血脂的作用。

表6 丹蔞片對AMPK信號通路相關(guān)基因mRNA表達的影響

3 討 論

心血管疾病仍然是造成居民死亡的首要原因，高脂血癥不僅是心血管疾病的危險因素之一，而且也是動脈粥樣硬化性疾病的起始因素和加重因素。中醫(yī)多將高脂血癥歸于“痰飲”“肥胖”“消渴”“眩暈” “痰濕”等病癥中，對高脂血癥的這種病理狀態(tài)多用“膏”“脂”“濁”進行概括[12]，屬本虛標(biāo)實。脾腎虧虛，無力運化，導(dǎo)致體內(nèi)痰瘀病理產(chǎn)物互相膠結(jié)，阻礙血脈，是高脂血癥的發(fā)病機制。高脂血癥患者肥胖者居多，腹部脂肪堆積嚴(yán)重，因此降低脂肪合成是關(guān)鍵[13]。

腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activatde protein kinase,AMPK)是一種絲氨酸蛋白激酶[14]，其主要分布在肝臟、骨骼肌等能量代謝活動旺盛的組織中。它參與體內(nèi)包括糖脂代謝在內(nèi)的多種能量代謝過程。AMPK可以通過調(diào)節(jié)與脂代謝相關(guān)的酶及因子活性來保持體內(nèi)脂代謝的平衡穩(wěn)定。因此又被稱為“能量代謝調(diào)節(jié)器”。固醇元件調(diào)節(jié)結(jié)合蛋白(Sterol regulatory element binding proteins，SREBPs)是脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，主要有三種亞型，SREBP-1a、SREBP-1c、SREBP-2，其中SREBP-1主要參與調(diào)控膽固醇、甘油三酯和脂肪酸的合成與攝取[15]，是AMPK蛋白的重點下游調(diào)控靶點。羥甲基戊二酸單酰輔酶還原酶(Hydroxy-methylglutaryl CoA reductase，HMGCR)是膽固醇合成過程中的限速酶，其活性的表達是調(diào)控膽固醇合成的主要因素之一[16]。研究表明[17]，AMPK 可以通過抑制 HMGCR 活性，減少膽固醇的體內(nèi)合成。由此可知，AMPK可直接通過對這些蛋白表達進行調(diào)節(jié)，從而調(diào)控脂質(zhì)合成與分解代謝。有研究顯示[18-19]，實驗對膽固醇合成的控制是可以通過激活A(yù)MPK對SREBP-1和 HMGCR的調(diào)節(jié)來實現(xiàn)的，同時表明了在高脂飲食條件下AMPK和SREBP-1的蛋白表達是呈負相關(guān)的。因此，AMPK 活性的降低可能會使脂質(zhì)沉積，導(dǎo)致以脂代謝異常為主的肥胖、高脂血癥、脂肪肝等代謝性疾病的發(fā)生。所以，AMPK 信號通路可通過調(diào)控脂質(zhì)合成來防止高脂血癥的發(fā)生。有研究表明[20]高脂血癥會使 AMPK 表達量下降，抑制 AMPK 信號通路及其下游靶基因使血清中 TC、TG、LDL-C指標(biāo)升高，促進了高脂血癥的發(fā)展。

本研究以高脂血癥APoE-/-小鼠為研究對象，對丹蔞片通過影響AMPK/SREBP信號通路降低血脂的作用及機制進行了深入的研究。與空白對照組相比，模型組血清TC、TG、LDL-C、ALT、AST含量顯著升高，HDL-C含量顯著降低，肝臟組織中AMPK基因及蛋白水平表達量明顯下降，SREBP-1、HMGCR基因及蛋白水平表達量顯著升高；與模型組相比，給藥組血清中TG、TC、LDL-C、AST、ALT含量顯著下降，HDL-C含量顯著升高，肝臟組織中AMPK基因及蛋白水平表達量明顯上升，SREBP-1、HMGCR蛋白含量顯著降低；各治療組組間比較，降低TC、LDL-C的作用效果聯(lián)合用藥組>瑞舒伐他汀鈣片組>丹蔞片高劑量組>丹蔞片低劑量組；降低TG和升高HDL-C的效果各治療組之間無統(tǒng)計學(xué)差異，降低ALT的效果聯(lián)合用藥組和丹蔞片高劑量組優(yōu)于瑞舒伐他汀鈣片組和丹蔞片低劑量組。

綜上所述，丹蔞片可以降低高脂血癥小鼠的血脂水平，可能與激活A(yù)MPK信號通路，抑制脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達有關(guān)。本研究為中成藥丹蔞片在治療高脂血癥方面提供新的有力證據(jù)和一定的創(chuàng)新思路。然而，丹蔞片體內(nèi)降血脂效果如何尚需進一步探索。