裂殖壺菌油脂成分及抗氧化活性分析

王孟杰 樓喬明 張 茹 黃 濤 張進杰 楊文鴿

(寧波大學食品與藥學學院，寧波 315800)

DHA(docosahexaenoic acid，C22∶6n-3)，又名二十二碳六烯酸，是一種重要的n-3型長鏈多不飽和脂肪酸，其能有效促進嬰幼兒神經系統和智力發育，調節血脂，預防心血管疾病，以及提高免疫力，增強抗炎和抗癌等多種重要生理功能[1，2]。目前，DHA作為重要的新型功能性保健因子，已廣泛應用于食品、保健品以及醫藥等行業[3-5]。

隨著功能性油脂行業的發展，DHA的生產方式也已從傳統深海魚油提取轉向為微生物發酵生產。裂殖壺菌(Schizochytriumlimacinum)，別名裂壺藻，是真菌門的一類單細胞海洋微生物，被認為是理想的DHA新生資源[6，7]。2010年國家衛生部將裂殖壺菌油脂列為新資源食品，其可替代魚油，作為功能性油脂用于嬰幼兒配方奶粉和多不飽和脂肪酸營養強化劑[8,9]。

目前，裂殖壺菌日益成為國內外學者關注的焦點，并在菌種選育培養和營養方面已有諸多文獻報道，但在其脂質成分及抗氧化活性方面卻鮮有報道。因此以裂殖壺菌干粉為原料，采用Folch法對其油脂進行提取，并通過氣相色譜-質譜和核磁共振技術分別對其脂肪酸組成和脂質成分進行分析，同時對油脂的自由基清除能力和總抗氧化能力進行測定，以期為裂殖壺菌油脂成分分析、營養評價和開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

裂殖壺菌干粉、氘代氯仿(CDCl3，氘代度99.8%+0.03%TMS)、水楊酸、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、TPTZ(三吡啶三吖嗪)和菲啰嗪等。

1.2 儀器與設備

RV-10型旋轉蒸發儀， 7890B型氣相色譜儀和5977A型質譜儀， AVANCE Ⅲ 400 MHz超導核磁共振譜儀， SpectraMax i3型多功能酶標儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 油脂提取[10]

采用Folch法對裂殖壺菌干粉油脂進行提取。稱取10 g裂殖壺菌干粉，加入200 mL三氯甲烷-甲醇混合液(2∶1)，超聲30 min，并浸提24 h；過濾后，濾液用50 mL 0.9%氯化鈉溶液振蕩洗滌，倒入分液漏斗中靜置分層；收集下層三氯甲烷，用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后，得到裂殖壺菌油脂。

1.3.2 脂肪酸分析

甲酯化衍生：取10 mg油脂，加入1 mL 5% H2SO4-CH3OH溶液，70 ℃水浴1 h；反應結束后冷卻至室溫，依次加入1 mL正己烷和0.5 mL蒸餾水，振蕩混勻后靜置分層，取上清液，經無水硫酸鈉干燥，用于GC-MS分析。

色譜條件：HP-INNOWax毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度250 ℃；升溫程序：初始溫度140 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升至210 ℃，保持15 min；進樣量1.0 μL，分流比20∶1；以氦氣為載氣，載氣流量1 mL/min，溶劑延遲時間3 min。

質譜條件：GC-MS接口溫度250 ℃，EI離子源，離子源溫度230 ℃，電離能量70 eV，質量掃描范圍：m/z50～500 u。

1.3.3 核磁共振分析

取50 mg裂殖壺菌油脂，用0.6 mL氘代氯仿溶解，并轉移至核磁管中用于核磁共振分析。采用標準的一維氫譜脈沖程序采集氫譜，氫去耦的碳譜脈沖程序采集碳譜。氫譜采集參數：探針溫度293.4 K，光譜儀頻率400.13 MHz，掃描次數16，空掃次數2，采集點數65 536，氫譜寬度8 012.82 Hz。碳譜采集參數：探針溫度294.0 K，光譜儀頻率100.62 MHz，掃描次數50，空掃次數4，采集點數65 536，碳譜寬度24 038.46 Hz。

1.3.4 抗氧化能力測定

裂殖壺菌油脂經無水乙醇超聲溶解，依次配制成質量濃度為10、20、30、40、50 mg/mL的溶液。DPPH自由基清除能力參照楊娜等[11]方法測定，羥基自由基清除能力參照李巨秀等[12]方法測定，ABTS+自由基清除能力參照楊皓彬等[13]方法測定，總抗氧化能力(FRAP法)參照Ting等[14]方法測定，并以維生素C為對照。

1.4 數據分析

除氣相色譜-質譜和核磁共振外，其他各項指標均平行測定3次；通過SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析，采用單因素方差分析法(ANOVE)進行顯著性檢驗，并采用Duncan法進行單因素多重比較分析，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 脂肪酸分析

裂殖壺菌油脂經甲酯化衍生后，采用GC-MS對其脂肪酸進行分析，其總離子流色譜圖見圖1，其脂肪酸分析鑒定結果列于表1。從表1可知，裂殖壺菌油脂脂肪酸組成簡單，以C14∶0(13.22%)、C16∶0(26.78%)、C22∶5n-6(DPA，13.66%)和C22:6n-3(DHA，42.04%)為主，且多不飽和脂肪酸含量(PUFA，58.94%)遠高于飽和脂肪酸(SFA，41.06 %)。C22∶6n-3，俗稱“腦黃金”，是目前已知的碳鏈最長的n-3型多不飽和脂肪酸，在嬰幼兒視網膜形成、神經發育和智力提高等方面起著關鍵作用；同時其亦具有調節血脂、預防心腦血管疾病、提高免疫活力以及參與炎癥反應、增強抗炎和抗癌能力等多種生理功能[15，16]。裂殖壺菌油脂富含C22∶6n-3，脂肪酸組成簡單，且與C22∶6n-3具有拮抗作用的結構類似脂肪酸C20∶5n-3含量較低(1.81%)，便于C22∶6n-3的工業化分離制備，因此裂殖壺菌油脂具有很高的營養價值，在食品和醫藥等領域，尤其是嬰幼兒食品方面的具有巨大開發潛力。

圖1 裂殖壺菌油脂脂肪酸組成的總離子流色譜圖

表1 裂殖壺菌油脂的脂肪酸組成

2.2 核磁共振分析

2.2.1 氫譜分析

裂殖壺菌油脂的核磁共振氫譜(1H-NMR)如圖2所示，其譜峰歸屬列于表2。從核磁共振氫譜可以區分來自飽和脂肪酸(SFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)的信號，且氫譜的譜峰積分與濃度直接成正比，可用以分析不同脂肪酸的比例[17]。從核磁共振氫譜可見，0.85～0.89譜峰為除n-3型多不飽和脂肪酸之外的其他脂肪酸末端甲基上的氫，0.95～0.98為n-3型多不飽和脂肪酸末端甲基上的氫，兩者譜峰積分比可計算出n-3型多不飽和脂肪酸酸的含量。2.28～2.35和2.37～2.43譜峰分別歸屬為飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸(C22∶6n-3和C22∶5n-6)2位上的氫；2.76～2.88譜峰為多不飽和脂肪酸雙鍵間亞甲基上的氫；4.13～4.17和4.28～4.32譜峰為甘油骨架中亞甲基上的氫；5.26～5.29譜峰為甘油骨架中次甲基上的氫；5.31～5.40譜峰歸屬為所有不飽和脂肪酸碳碳雙鍵上的氫。同時，從核磁共振氫譜中未見磷脂酰膽堿(PC)中與氮原子相連的甲基((CH3)3N—)上的氫(3.33)，以及磷脂酰乙醇胺(PE)中與氮原子相連的亞甲基(—CH2N)上的氫(3.79)[18]。從核磁共振氫譜可知裂殖壺菌油脂富含n-3型多不飽和脂肪酸，且油脂以甘油三酯為主，不含磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺等磷脂成分。

圖2 裂殖壺菌油脂的核磁共振氫譜圖

表2 裂殖壺菌油脂的核磁共振氫譜譜峰歸屬

2.2.2 碳譜分析

裂殖壺菌油脂的核磁共振碳譜(13C-NMR)如圖3所示，其譜峰歸屬列于表3。碳譜分辨率高，譜峰重疊程度低，致使裂殖壺菌油脂的核磁共振碳譜比氫譜出峰多且復雜[19]。從核磁共振碳譜中可觀察到5個譜區：甲基譜區(11～15)、亞甲基譜區(20～40)、甘油譜區(50～75)、烯烴譜區(121～141)和羰基譜區(172～180)[18，20]。

圖3 裂殖壺菌油脂的核磁共振碳譜圖

表3 裂殖壺菌油脂的核磁共振碳譜譜峰歸屬

續表3

在甲基譜區(11～15)，n-6型多不飽和脂肪酸(主要為C22∶5n-6)、飽和脂肪酸(主要為C16∶0和C14∶0)以及n-3型多不飽和脂肪酸(主要為C22∶6n-3) 中甲基譜峰的化學位移分別14.08、14.12和14.27，譜峰區分明確；同時通過譜峰積分比較，可直接證明裂殖壺菌油脂中的二十二碳五烯酸(DPA)為n-6型多不飽和脂肪酸(C22∶5n-6)，而非n-3型多不飽和脂肪酸(C22∶5n-3)，這與氣相色譜-質譜定性結果一致，亦與Zhu和Ashford等學者的脂肪酸定性分析結果一致[21，22]。在甘油譜區(50～75)，61.99～62.16和68.88～69.00分別歸屬為甘油三酯中甘油骨架上sn-1,3和sn-2位碳原子。在羰基譜區(172～178)，172.04譜峰歸屬為結合于甘油三酯sn-2位上C22∶6n-3和C22∶5n-6的羰基碳原子，172.42譜峰歸屬為結合于甘油三酯sn-1,3位上C22∶6n-3和C22∶5n-6的羰基碳原子；172.75～172.95譜峰歸屬為除C22∶6n-3和C22∶5n-6外所有結合于甘油三酯sn-2位上脂肪酸的羰基碳原子，173.14譜峰歸屬為除C22∶6n-3和C22∶5n-6外所有結合于甘油三酯sn-1,3位上脂肪酸的羰基碳原子，而178.57譜峰歸屬為游離脂肪酸的羰基碳原子，因此可根據碳譜中羰基碳原子的化學位移快速鑒定甘油骨架上sn-1,3位和sn-2位上結合的脂肪酸類型[17]。從核磁共振碳譜可知裂殖壺菌油脂以甘油三酯為主，含有少量的游離脂肪酸；且C22∶6n-3和C22∶5n-6等多不飽和脂肪酸主要結合于甘油三酯的sn-2位，這與齊冬梅等[5]采用超高效液相色譜-質譜技術所得的C22∶6n-3和C22∶5n-6分布趨勢一致。

2.3 自由基清除能力

自由基易與細胞膜磷脂中多不飽和脂肪酸的碳碳雙鍵發生反應造成細胞膜破壞，并進而引發細胞內DNA的氧化損傷，是加速人體衰老和誘發某些疾病的重要原因之一[23]。裂殖壺菌油脂對DPPH自由基、ABTS+自由基和羥基自由基(·OH)的清除能力見圖4。從圖4可知，裂殖壺菌油脂質量濃度在10～50 mg/mL范圍內，其對DPPH自由基、ABTS+自由基和羥基自由基均具有一定清除能力，且隨著質量濃度的增加，自由基清除率顯著增加(P<0.05)，并呈現典型的量效關系；當裂殖壺菌油脂質量濃度為50 mg/mL時，對三種自由基的清除率分別達到77.81%、67.44%、56.19%；同時通過擬合計算得到裂殖壺菌油脂對DPPH自由基、ABTS+自由基和羥基自由基的半清除率(IC50值)分別為32.16、36.21、40.58 mg/mL，均高于維生素C，表明裂殖壺菌油脂具有較好的自由基清除能力，但清除能力均弱于維生素C。

圖4 裂殖壺菌油脂的自由基清除率

2.4 總抗氧化能力

FRAP法是抗氧化物在酸性條件下還原Fe3+-TPTZ產生藍紫色Fe2+-TPTZ，通常抗氧化物對Fe3+-TPTZ的還原能力與抗氧化能力成正相關，在593 nm處測定Fe2+-TPTZ即可獲得抗氧化物的總抗氧化能力[24，25]。FRAP法作為總抗氧化能力的評價指標已廣泛應用于食品和保健品的抗氧化能力分析。總抗氧化能力測定標準曲線，如圖5所示。由圖5可知，在0～0.6 mmol/L范圍內，FeSO4濃度與其在593 nm處吸光值成良好線性關系。標準曲線方程：y=1.827 7x-0.018 9(R2=0.997 6)，表明以593 nm處吸光值換算成裂殖壺菌油脂的FeSO4當量濃度的方法是可行的[13]。

裂殖壺菌油脂的總抗氧化能力結果如圖6所示。由圖6可知，裂殖壺菌油脂具有一定的抗氧化能力，且隨著質量濃度的增加，其總抗氧化能力顯著增加(P<0.05)，且增加趨勢呈線性關系，線性回歸方程：y=0.011 9x-0.032 3(R2=0.991 6)，表明方程的擬合度較好。當裂殖壺菌油脂的質量濃度為50 mg/mL時，其總抗氧化能力達到0.57 mmol/L，但遠低于維生素C，表明裂殖壺菌油脂具有較好的總抗氧化能力，且呈顯著量效關系，但弱于同等質量濃度的維生素C。

圖5 總抗氧化測定標準曲線

圖6 裂殖壺菌油脂的總抗氧化能力

3 結論

裂殖壺菌油脂的脂肪酸以C14∶0(13.22%)、C16∶0(26.78%)、C22∶5n-6(13.66)和C22∶6n-3(42.04%)為主；其油脂成分以甘油三酯為主，含有少量游離脂肪酸，但不含磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿等磷脂成分，且C22∶6n-3和C22∶5n-6等多不飽和脂肪酸主要結合于甘油三酯的sn-2位。同時，裂殖壺菌油脂具有較好的DPPH自由基、ABTS+自由基和羥基自由基的清除能力和總抗氧化能力，且在10～50 mg/mL范圍內呈現顯著的量效關系(P<0.05)。裂殖壺菌油脂富含C22∶6n-3以及較好的抗氧化能力，表明裂殖壺菌油脂具有較高的營養價值和脂質開發潛力，可作為C22∶6n-3的重要生物來源，在食品和醫藥等領域具有巨大應用潛力。