檸檬酸和枯草芽胞桿菌協(xié)同強(qiáng)化萬(wàn)壽菊提取土壤中鈾

馬 靜，龐彩燕，丁志超，譚國(guó)熾，石 濤，孫 靜，李廣悅

(南華大學(xué) 資源環(huán)境與安全工程學(xué)院， 湖南 衡陽(yáng) 421001)

0 引 言

鈾的植物提取是將土壤中的鈾離子吸收、轉(zhuǎn)移并貯存于植物體內(nèi)，并通過(guò)收獲和處理植物，實(shí)現(xiàn)土壤的修復(fù)和資源的回收。植物提取技術(shù)具有保持土壤肥力[1]、增加土壤微生物多樣性[2]、安全、高效等優(yōu)點(diǎn)，在提取土壤中鈾的方面具有良好的應(yīng)用前景。

利用植物從土壤中高效提取鈾，取決于土壤中鈾的生物可利用態(tài)、植物對(duì)鈾的富集性能以及植物生物量。添加螯合劑可以增加土壤中鈾的生物可利用態(tài)。其中天然低分子有機(jī)酸可生物降解，對(duì)土壤破壞較小，可與鈾形成配合物，從而被植物富集，是理想的天然螯合劑[3]。添加檸檬酸到含鈾土壤后，芥菜葉片中的鈾積累可以達(dá)到2 225 mg/kg[4]。而內(nèi)生細(xì)菌能夠直接影響植物生長(zhǎng)素及與植物生長(zhǎng)代謝功能相關(guān)的微生物活性，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增加植物的生物量[5]。研究表明，添加枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)不僅促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增加病原體抗性[6]，還可以強(qiáng)化植物提取土壤中的重金屬[7]。

利用高生物量的菊科景觀植物從土壤中提取鈾，具有美化環(huán)境和凈化土壤的雙重優(yōu)勢(shì)。研究表明，萬(wàn)壽菊具有富集鎘的能力，在10 mg/kg、100 mg/kg的鎘(Cd)土壤中，富集含量分別達(dá)到6.79±0.08 μg/(plant·d)、27.45±0.16 μg/(plant·d)[8]。在含銅[9]、鉛[10]等土壤中，萬(wàn)壽菊也表現(xiàn)出良好的吸收和積累效果。但目前在鈾的提取中仍未報(bào)道。

為了研究菊科景觀植物對(duì)土壤中鈾的提取效果，本文以芙蓉菊和萬(wàn)壽菊為供試植物，研究了其提取土壤中鈾的效果，以及檸檬酸和枯草芽胞桿菌對(duì)兩種植物的協(xié)同強(qiáng)化作用，以期為菊科植物提取土壤中鈾提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試土壤

供試土壤按鈾礦石∶土壤=1∶4的體積比混合(鈾礦石取自江西某礦山，土壤取自南華大學(xué)園內(nèi)土)。采用圓錐四分法進(jìn)行取樣，根據(jù)GB/T13070—1991標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定鈾品位。表1為含鈾土壤的理化性質(zhì)。

表1 含鈾土壤的理化性質(zhì)Table 1 Physiocochemical properties of uranium-containing soil

1.1.2 供試植物

供試植物為萬(wàn)壽菊、芙蓉菊，其幼苗購(gòu)自河南商丘某花店。

1.1.3 供試菌種

供試菌種為枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis，CICC 10155)，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.4 培養(yǎng)基

1)液體培養(yǎng)基：5.0 g/L蛋白胨，3.0 g/L牛肉浸取物，5.0 g/L NaCl，5 mg/L MnSO4·H2O，調(diào)節(jié)pH值為7.0。

2)斜面培養(yǎng)基：5.0 g/L蛋白胨，3.0 g/L牛肉浸取物，5.0 g/L NaCl，15.0 g/L瓊脂，5 mg/L MnSO4·H2O，調(diào)節(jié)pH值為7.0。

1.1.5 檸檬酸

檸檬酸購(gòu)于湖南省衡陽(yáng)市化學(xué)試劑廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的制備

在超凈工作臺(tái)上，挑取一環(huán)斜面培養(yǎng)基上的B.subtilis于20 mL液體培養(yǎng)基中，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)。靜置培養(yǎng)3 d后，加入液體培養(yǎng)基調(diào)整菌懸液濃度為1×109cfu/mL，作為備用菌懸液。

1.2.2 檸檬酸及B.subtilis的添加方式

1)添加檸檬酸到土壤中：將1.5 mol/L的檸檬酸均勻的添加到距離土壤表面20 cm的土壤層中；

2)添加B.subtilis到土壤中：將培養(yǎng)好的B.subtilis均勻的傾倒于植物根部周圍距離土壤表面20 cm的土壤層中；

3)注射B.subtilis到植物根部：利用注射器將培養(yǎng)好的B.subtilis注入到植物根部。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)處理與分組

芙蓉菊和萬(wàn)壽菊幼苗種植于4 kg的供試土壤中，置于濕度約為60%、溫度為25～30 ℃的溫室大棚中培養(yǎng)。每種植物設(shè)1個(gè)對(duì)照組(CK1、CK2)和3個(gè)處理組。3個(gè)處理組分別為：?jiǎn)为?dú)添加檸檬酸組(H1、D1)、同時(shí)添加檸檬酸與B.subtilis到土壤組(H2、D2)、添加檸檬酸到土壤并注射B.subtilis到植物根部組(H3、D3)。每個(gè)處理組含4株植物，共32株植物，實(shí)驗(yàn)處理與分組詳見(jiàn)表2。在植物生長(zhǎng)過(guò)程中，采用補(bǔ)光燈補(bǔ)充光照以確保植物受光均勻；按需澆水以確保植物土壤保持濕潤(rùn)；每隔7 d噴灑一次營(yíng)養(yǎng)液以確保植物生長(zhǎng)所需的養(yǎng)分充足。

表2 實(shí)驗(yàn)分組與處理Table 2 Experimental grouping and treatment methods

1.2.4 植物樣品處理

植物生長(zhǎng)75 d后，分別收割地上部分和地下部分，首先利用自來(lái)水沖洗掉表面的灰塵、土壤等雜質(zhì)，然后浸泡于20 mmol/L的乙二胺四乙酸二鈉中20 min，再用超純水沖洗4～5遍。

1.3 分析方法

1.3.1 植物生物量測(cè)定

將洗凈的植物用吸水紙吸干表面水分，用電子天平稱得其鮮重；然后將植物置于105 ℃的烘箱中殺青0.5 h，調(diào)節(jié)溫度至85 ℃烘干至恒重，冷卻后用電子天平稱得其干重；準(zhǔn)確稱量烘干后的植物于200 mL坩堝中，放入馬弗爐，在550 ℃下灰化6 h，冷卻至室溫后研磨，稱其灰重[11-13]。

1.3.2 植物樣品鈾濃度測(cè)定

灰化后的植物樣品采用王水∶高氯酸=2∶1(體積比)的消解液進(jìn)行消解。加熱3%～5%的稀硝酸至60 ℃以上，將消解后的樣品用熱的稀硝酸沖洗過(guò)濾，于25 mL容量瓶中定容，然后將待測(cè)液置于4 ℃冰箱中保藏待測(cè)。根據(jù)GB/T11220.1—1989的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定鈾濃度。

1.3.3 植物葉片中酶含量的測(cè)定

1)過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，以測(cè)定植物葉片中POD活性；

2)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性試劑盒購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司，以測(cè)定植物葉片中SOD活性。

1.3.4 植物葉片中丙二醛(MDA)含量的測(cè)定

采用硫代巴比妥酸法[14]測(cè)定植物葉片中丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。

1.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析方法

采用SPSS 24軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的單因素(Analysis of Variance，ANOVA)ANOVA檢驗(yàn)和方差分析(P<0.05)，Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同處理方式對(duì)植物生物量的影響

不同處理方式對(duì)芙蓉菊和萬(wàn)壽菊生物量的影響分別見(jiàn)表3和表4。

表3 不同處理方式下芙蓉菊的生物量Table 3 Biomass of Crossostephium chinense (L.) Makino under different treatments

表4 不同處理方式下萬(wàn)壽菊的生物量Table 4 Biomass of Tagetes erecta L. under different treatments

對(duì)于芙蓉菊，與對(duì)照組CK1相比，H1組的總鮮重和總干重均顯著增大。H2組的總鮮重與總干重也比CK1組顯著增大(P<0.05)，但其總干重與H1組基本一致，說(shuō)明添加檸檬酸并加入B.subtilis到土壤中對(duì)芙蓉菊的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著的作用。H3組總干重比CK1組沒(méi)有顯著性增加，且顯著低于H1和H2組，說(shuō)明注射B.subtilis到芙蓉菊根部，反而對(duì)芙蓉菊生長(zhǎng)產(chǎn)生了不利的影響。

對(duì)于萬(wàn)壽菊，與對(duì)照組CK2相比，D1組的總鮮重和總干重均顯著增大(P<0.05)。D2組的總鮮重與總干重比CK2組和D1組均顯著增大，D2組的總鮮重比CK2組和D1組分別增大了164.45%和83.97%，D2組的總干重比CK2組和D1組分別增大了83.56%和48.32%(P<0.05)，說(shuō)明添加檸檬酸并加入B.subtilis到土壤中對(duì)芙蓉菊的生長(zhǎng)具有協(xié)同作用。D3組的總干重比CK2組略有降低，且顯著低于D1組和D2組，說(shuō)明添加檸檬酸并注射B.subtilis到萬(wàn)壽菊根部，不但沒(méi)有協(xié)同作用，且抑制了萬(wàn)壽菊的生長(zhǎng)。

在鈾的脅迫環(huán)境下，檸檬酸能夠與鈾離子螯合，降低毒性，從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，提高生物量[15]。U.Najeeb[16]等報(bào)道，檸檬酸添加到含錳的土壤中使紅豆的地上干重和地下干重分別增加了5.09%和17.22%。B.subtilis是根際促生細(xì)菌，可促進(jìn)植物生長(zhǎng)。在含鈾水中添加B.subtilis后的鳳眼蓮的根系與莖葉的干重分別增加了34.80%和22.00%[17]。本研究表明，添加檸檬酸并注射B.subtilis到土壤中時(shí)，兩者對(duì)萬(wàn)壽菊的生長(zhǎng)具有協(xié)同作用，但對(duì)芙蓉菊協(xié)同作用不明顯，這可能是由于不同植物對(duì)B.subtilis的適應(yīng)性不同造成的。此外，添加檸檬酸并注射B.subtilis到植物根部時(shí)，兩者不但沒(méi)有協(xié)同作用，反而不利于芙蓉菊和萬(wàn)壽菊生長(zhǎng)，這可能是由于施加于根部造成植物體內(nèi)菌液濃度過(guò)高所致。

2.2 植物葉片中的生理指標(biāo)

2.2.1 丙二醛(MDA)含量

不同處理方式下芙蓉菊和萬(wàn)壽菊MDA含量的影響如圖1所示。

植物在逆境脅迫下會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化產(chǎn)生MDA。因此，MDA代表了膜脂的過(guò)氧化程度，也間接反應(yīng)了自由基的含量[18]。圖1為不同處理方式對(duì)植物葉片MDA含量的影響。在三種處理方式下，芙蓉菊和萬(wàn)壽菊葉片中的MDA含量均比對(duì)照組顯著降低，說(shuō)明單獨(dú)添加檸檬酸、或者同時(shí)添加檸檬酸和B.Subtilis都降低了鈾對(duì)兩種植物的脅迫，這與其生物量都提高的結(jié)果相一致。對(duì)于芙蓉菊，添加檸檬酸并加入B.subtilis到土壤的H2組，MDA含量顯著性降低，達(dá)到了(0.96±0.07) μmol/L，說(shuō)明兩者具有協(xié)同作用；而對(duì)于萬(wàn)壽菊，結(jié)果卻相反，這可能是因?yàn)镈2組的鈾含量升高導(dǎo)致脅迫加大，因而其MDA含量高于其他處理組[19]。

圖1 不同處理方式下的MDA含量Fig.1 Effect on MDA contents of plants leaves under different treatments 注：不同字母，表示的是組間具有顯著性差異(P<0.05)

2.2.2 超氧化物歧化酶(SOD)活性

不同處理方式下芙蓉菊和萬(wàn)壽菊SOD活性的影響如圖2所示。

圖2 不同處理方式對(duì)植物SOD活性的影響Fig.2 Effect on SOD activity of plants leaves under different treatments 注：不同字母，表示的是組間具有顯著性差異(P<0.05)

SOD可清除植物體內(nèi)的自由基和過(guò)氧化物，其反應(yīng)了植物在環(huán)境脅迫下的抗氧化能力[20]。圖2為不同處理方式對(duì)植物SOD活性的影響。在三種處理方式下，芙蓉菊的SOD活性均比對(duì)照組顯著提高，其中H1組和H3組的增加幅度基本一致，H2組的增加幅度最小。對(duì)于萬(wàn)壽菊，D1組和D2組的SOD活性比對(duì)照組顯著增加，但D3組卻顯著下降。每種處理方式下，植物葉片的SOD活性結(jié)果與MDA含量結(jié)果相一致，呈正相關(guān)，這說(shuō)明鈾脅迫產(chǎn)生的自由基誘導(dǎo)了抗氧化酶活性。

2.2.3 過(guò)氧化物酶(POD)活性

不同處理方式下芙蓉菊和萬(wàn)壽菊POD活性的影響如圖3所示。

POD是植物抗氧化系統(tǒng)中一種重要的酶，其活性與植物抗逆境呈正相關(guān)[21]。圖3為不同處理方式對(duì)植物POD活性的影響。結(jié)果表明，三種不同處理方式下，芙蓉菊的POD活性均略有提高，其中H2組的POD活性最大，但三者無(wú)顯著性差異。萬(wàn)壽菊在三種處理方式下，D1組和D3組的POD活性均高于對(duì)照組，而D2組略有降低。楊瑞麗等[22]研究結(jié)果表明檸檬酸能夠提高黑麥草中POD活性，肖亞靜等[23]研究結(jié)果表明B.Subtilis菌株21使玉米的POD活性升高。本研究表明，單獨(dú)添加檸檬酸可增加芙蓉菊和萬(wàn)壽菊的POD活性，提高兩種植物抗鈾的脅迫。添加檸檬酸并注射B.subtilis到植物根部時(shí)，也可增加兩種植物的POD活性。而添加檸檬酸并加入B.Subtilis到土壤時(shí)，兩種植物呈現(xiàn)相反的結(jié)果，這可能由于D2組的植物體內(nèi)鈾含量明顯高于其他組而導(dǎo)致其抗脅迫有所減低。

圖3 不同處理方式對(duì)植物POD活性的影響Fig.3 Effect on POD activity of plants leaves under different treatments 注：不同字母，表示的是組間具有顯著性差異(P<0.05)

2.3 不同處理方式對(duì)植物提取鈾的影響

不同處理方式下芙蓉菊和萬(wàn)壽菊富集鈾的結(jié)果分別見(jiàn)表5和表6。

表5 不同處理方式下芙蓉菊富集鈾含量Table 5 Enrichment of uranium by Crossostephium chinense (L.) Makino under different treatments

表6 不同處理方式下萬(wàn)壽菊富集鈾含量

對(duì)于芙蓉菊，與對(duì)照組CK1相比，H1組的鈾富集總量略有增加，但其地上和地下部分鈾含量增加不明顯，其鈾富集總量的增加是由于生物量的增加導(dǎo)致的。H2組的地上部分和鈾富集總量比CK1組也略有增加，但與H1組無(wú)顯著性差異，且其地下部分鈾含量比CK1組和H1組均顯著下降，分別為107.75±24.81 mg/kg和0.27 mg/plant，說(shuō)明添加檸檬酸并加入B.subtilis到土壤中，對(duì)強(qiáng)化芙蓉菊富集鈾沒(méi)有協(xié)同作用。H3組的鈾富集總量與CK1組基本一致，低于H1組和H2組，這是由于將B.subtilis注射到芙蓉菊根部無(wú)法顯著性促進(jìn)芙蓉菊生長(zhǎng)所致。

對(duì)于萬(wàn)壽菊，與對(duì)照組CK2相比，D1組的鈾富集總量顯著增加，且其地上部分鈾含量明顯增大，說(shuō)明檸檬酸提高了鈾的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。D2組的鈾富集總量比CK2組和D1組均明顯增加，分別提高了207.41%和76.60%，但其地上部分較D1組顯著下降，其對(duì)鈾的富集協(xié)同作用是由于植物生物量增加引起的。D3組與D1組的鈾富集總量基本一致，但顯著低于D2組，說(shuō)明將B.subtilis添加到萬(wàn)壽菊根部時(shí)，不能促進(jìn)植物對(duì)鈾的富集。

E.Sevostianova等[24]研究了肥料和檸檬酸處理后的不同植物富集鈾的效果，結(jié)果表明，檸檬酸促進(jìn)了地膚、向日葵、和甜玉米對(duì)鈾的吸收，使得地上部分分別增加138.46%、204.17%和26.09%，提高了鈾的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。W.Liu等[25]表明B.subtilis促進(jìn)了土壤中的鎘含量，且能夠與納米羥基磷灰石協(xié)同強(qiáng)化油菜提取含鎘土壤中的鎘。本研究表明，同時(shí)添加檸檬酸和B.subtilis到土壤中，對(duì)萬(wàn)壽菊提取土壤中的鈾具有顯著的協(xié)同強(qiáng)化作用，但對(duì)于芙蓉菊無(wú)協(xié)同強(qiáng)化作用，這可能與植物種類對(duì)B.subtilis的適應(yīng)性有關(guān)。

3 結(jié) 論

1)同時(shí)添加檸檬酸和B.subtilis到土壤中，兩者可協(xié)同促進(jìn)萬(wàn)壽菊的生長(zhǎng)，生物量提高了83.56%，但對(duì)芙蓉菊效果不明顯；添加檸檬酸并注射B.subtilis到植物根部時(shí)，反而對(duì)芙蓉菊和萬(wàn)壽菊的生長(zhǎng)產(chǎn)生了不利的影響。

2)同時(shí)添加檸檬酸和B.subtilis到土壤中，兩者對(duì)萬(wàn)壽菊富集鈾具有協(xié)同作用，鈾富集總量提高了207.41%，但對(duì)芙蓉菊協(xié)同效果不明顯；添加檸檬酸并注射B.subtilis到植物根部時(shí)，對(duì)芙蓉菊和萬(wàn)壽菊富集鈾均無(wú)協(xié)同作用。

3)檸檬酸和B.Subtilis可增加芙蓉菊和萬(wàn)壽菊的抗氧化性，提高其對(duì)鈾的耐受性，使其MDA含量顯著降低。鈾脅迫產(chǎn)生的自由基誘導(dǎo)了植物的抗氧化酶活性，植物的SOD活性與MDA含量呈正相關(guān)。在鈾含量較低時(shí)，檸檬酸和B.Subtilis可使兩種植物的POD活性增高，但高濃度的鈾脅迫下POD活性下降。