miR-21對缺氧/復(fù)氧損傷后大鼠腎小管上皮細胞的影響

胡紅林，習(xí)小慶，葉真逢，黃雅為，黃瑞禎

南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，南昌330006

腎缺血再灌注損傷（IRI）是缺血性急性腎功能衰竭的重要環(huán)節(jié)，也是影響移植腎早期功能及長期存活的主要因素。腎IRI 的病理生理機制非常復(fù)雜，至今尚未徹底闡明。腎小管上皮細胞缺氧/復(fù)氧（H/R）損傷是腎IRI 的病理過程之一，包含細胞凋亡、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥等［1-2］。前期研究表明，外源性的microRNA-21 前體（pre-miR-21）在腎IRI 早期可誘導(dǎo)腎臟miR-21 高表達且具有明顯的腎臟保護作用，其作用機制可能與抑制程序性細胞凋亡因子4（PDCD4）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）通路有關(guān)［3］。2019 年 7 月—2020 年 6月，本研究探討miR-21對H/R損傷后大鼠腎小管上皮細胞（NRK-52E細胞）的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑及儀器 NRK-52E 細胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。miR-21 激活劑（pre-miR-21）、拮抗劑（antagomiR-21）購自廣州銳博生物科技有限公司，RTPCR 引物由廣州銳博生物科技有限公司合成，兔抗鼠Caspase-3 抗體、β-actin 抗體、辣根過氧化物酶購自美國Santa Cruz 公司。TaqMan miRNA RT 試劑盒購自日本寶生物工程株式會社，CCK-8 法試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司，ELISA 試劑盒、抗氧化檢測試劑盒購自美國Santa Cruz 公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、分組及預(yù)處理 NRK-52E 細胞用含1 g/L 葡萄糖、10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入50 mL 培養(yǎng)瓶中置入37 ℃（5%CO2）培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。將NRK-52E 細胞隨機分為4 組，pre-miR-21+H/R 組、antagomiR-21+H/R 組、模型組、正常組。pre-miR-21+H/R 組、antagomiR-21+H/R 組細胞在缺氧處理前24 h 分別在培養(yǎng)基中加入pre-miR-21、antagomiR-21 預(yù) 處 理 ，終 濃 度 均 為30 nmol/L。

1.3 H/R 損傷模型構(gòu)建 缺氧溶液使用D-Hanks液，復(fù)氧溶液使用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基。將D-Hanks 液置于含N2密閉容器中平衡1 h 以上制成無氧液，將培養(yǎng)瓶中含氧的正常培養(yǎng)基吸出，加入無氧液，隨后將培養(yǎng)瓶置于含95% N2、5% CO2混合氣體的密閉容器中，于37 ℃缺氧孵育4 h；更換為正常培養(yǎng)基，放回培養(yǎng)箱，復(fù)氧孵育12 h。pre-miR-21+H/R 組、antagomiR-21+H/R 組、模型組按上述方法進行處理，正常組按1.2常規(guī)培養(yǎng)。

1.4 細胞活力檢測 采用CCK-8 法。將各組細胞接種到96孔培養(yǎng)板中，加入CCK-8 10 μL，37 ℃孵育4 h，置于450 nm 波長處測定吸光度值。細胞活力=［（實驗組吸光度-對照組吸光度）/對照組吸光度］×100%。

1.5 細胞凋亡能力檢測 采用流式細胞術(shù)。收集細胞，用PBS緩沖液1 mL洗滌2次，1 500 r/min離心3 min（離心半徑15 cm），加入Binding Buffer 300 μL重懸細胞，加入 Annexin V-FITC 3 μL 混勻，加入PIPE 5 μL 混勻，室溫、避光，反應(yīng)10 min，再用Binding Buffer 200 μL 混勻，上機檢測各組細胞凋亡情況，計算凋亡率。

1.6 細胞內(nèi)miR-21和PDCD4 mRNA表達檢測 采用RT-PCR。收集細胞，采用TRIzol 法提取總RNA，miR-21、PDCD4、內(nèi)參U6逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成模板cDNA，置入-20 ℃冰箱冷凍保存。PCR 循環(huán)40 次。反應(yīng)體系 20 μL（含引物、4 種dNTP、Taq DNA 聚合酶、反應(yīng)緩沖液等），取2 μL 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物分別與 miR-21、PDCD4 引物、內(nèi)參照 U6 引物進行反應(yīng)，將各PCR反應(yīng)管放入DNA擴增儀，94 ℃5 min，然后按以下條件進行熱循環(huán)：94 ℃ 45 s、56 ℃ 30 s、72 ℃30 s，循環(huán) 40 次，最后 72 ℃延伸 10 min，按 RT-PCR使用說明書在ABI PRISM 7300 RT-PCR System 上操作。miR-21 上游引物序列：5'-ACGTTGTGTAGCTTATCAGACTG-3'，下游引物序列：5'-AATGGTTGTTCTCCACACTCTC-3'；PDCD4 上游引物序列：5'-TCTTTCACATCCACCTCTTCCACAT-3'，下游引物序列 ：5'-GACCCTGACAATTTAAGCGACTCTC-3'。 用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.7 細胞內(nèi)Caspase-3 蛋白表達檢測 采用Western blotting法。各組細胞在冰塊上制作成細胞勻漿，于4 ℃，3 000 r/min離心10 min，離心半徑15 cm。采用考馬斯亮蘭法檢測蛋白濃度。每組樣本取含200 μg 總蛋白的細胞裂解液，蛋白質(zhì)孔上樣后，經(jīng)10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。硝酸纖維素膜經(jīng)5%脫脂牛奶封閉過夜，再加兔抗鼠Caspase-3 抗體（1∶400）于4 ℃孵育過夜。加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標記的二抗。按照ECL免疫檢測試劑盒操作說明書進行顯色、曝光、X 光片沖洗，掃描后采用Image Pro Plus 軟件測量條帶灰度值，內(nèi)參照為β-actin。目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.8 細胞抗氧化酶活性和總抗氧化能力檢測 各組制作細胞勻漿并檢測蛋白濃度。應(yīng)用化學(xué)比色法檢測超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽還原酶（GSH）及過氧化氫酶（CAT），應(yīng)用終點比色法檢測總抗氧化能力（TAC）。

1.9 細胞培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）檢測 收集各組細胞培養(yǎng)上清液，用ELISA法檢測TNF-α、IL-6。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 GraphPad5.0 統(tǒng)計軟件。計量資料符合正態(tài)分布用表示，多組比較采用方差分析及Tukey post-hoc 檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞活力比較 正常組、模型組、pre-miR-21+H/R 組、antagomiR-21+H/R 組細胞活力分別為100%、（45.40± 4.35）%、（77.77±5.71）%、（42.88±8.71）%。與正常組比較，模型組細胞活力低（P＜0.05）；與模型組比較，pre-miR-21+H/R 組細胞活力高（P＜0.05）；antagomiR-21+H/R 組細胞活力與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 各組細胞凋亡能力比較 正常組、模型組、pre-miR-21+H/R 組、antagomiR-21+H/R 組細胞凋亡率 分 別 為（3.39 ± 2.35）% 、（35.28 ± 4.51）% 、（12.34 ± 3.18）%、（37.11 ± 4.92）%。與正常組比較，模型組細胞凋亡率高（P＜0.05）；與模型組比較，pre-miR-21+H/R 組 細 胞 凋 亡 率 低（P＜0.05）；antagomiR-21+H/R 組細胞凋亡率與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 各組miR-21、PDCD4 mRNA表達比較 見表1。

表1 各組miR-21、PDCD4 mRNA相對表達量比較（）

表1 各組miR-21、PDCD4 mRNA相對表達量比較（）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

組別正常組模型組pre-miR-21+H/R組antagomiR-21+H/R組miR-21 100 120.32±7.72a 175.79±8.23b 41.70±5.29b PDCD4 mRNA 100 72.62±5.51a 52.22±4.18b 75.15±6.34

2.4 各組Caspase-3蛋白表達比較 見表2。

表2 各組Caspase-3蛋白相對表達量比較（）

表2 各組Caspase-3蛋白相對表達量比較（）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

組別正常組模型組pre-miR-21+H/R組antagomiR-21+H/R組Caspase-3蛋白剪切片段P17 0.19±0.06 0.41±0.05a 0.18±0.04b 0.45±0.03 Pro-Caspase-3蛋白0.53±0.02 0.56±0.03 0.54±0.02 0.51±0.03

2.5 各組細胞抗氧化酶活性和總抗氧化能力 見表3。

表3 各組細胞抗氧化酶活性及總抗氧化能力比較（）

表3 各組細胞抗氧化酶活性及總抗氧化能力比較（）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

組別正常組模型組pre-miR-21+H/R組antagomiR-21+H/R組TAC（mmol/mg蛋白）0.75±0.17 0.34±0.11a 0.68±0.19b 0.35±0.13 SOD（U/mg蛋白）7.93±2.16 3.89±1.28a 7.17±1.09b 3.95±0.79 GSH（μmol/mg蛋白）32.81±4.82 12.56±1.92a 25.61±3.75b 11.90±0.97 CAT（U/mg蛋白）365.69±14.31 189.59±17.81a 315.41±12.62b 187.12±6.87

2.6 各組炎癥細胞因子水平比較 見表4。

表4 各組炎癥細胞因子水平比較（pg/mL，）

表4 各組炎癥細胞因子水平比較（pg/mL，）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

組別正常組模型組pre-miR-21+H/R組antagomiR-21+H/R組IL-6 80.49±8.34 185.71±13.71a 128.26±10.94b 190.35±11.17 TNF-α 1 100.57±78.56 2 489.39±115.78a 1 572.62±123.92b 2 512.75±108.09

3 討論

miRNA 是一類約含22個核苷酸的內(nèi)源性、小非編碼單鏈RNA，參與了系列病理生理過程，在腎細胞、心肌細胞、血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞等表達［4］。雖然miR-21在腎臟疾病中的生理功能尚未完全闡明，但報道顯示，miR-21 在腎IRI 中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，IRI 后腎組織中多種miRNA（miR-21、miR-7 和 miR-192）表達上調(diào)，而 miR-322 表達下調(diào)［5］。通過缺血預(yù)處理上調(diào)miR-21 的表達，有助于保護腎臟，然而，腎 IRI 時敲除 miR-21 對腎 IRI 無影響［6］。miR-21 可通過與 HIF 相互作用減輕腎 IRI 后腎小管上皮細胞損傷，通過PDCD4/NF-κB通路抑制樹突狀細胞的成熟［7］。我們前期研究結(jié)果表明，pre-miR-21 在腎IRI 早期可以誘導(dǎo)腎臟miR-21 高表達并且參與腎臟保護，其作用機制可能與抑制PDCD4/Caspase-3通路有關(guān)［3］。

PDCD4 是細胞凋亡的關(guān)鍵因子。PDCD4 是最早在腎癌中證實的miR-21 的靶基因，被認為是一種前凋亡基因。PDCD4 蛋白幾乎存在所有組織的細胞核和細胞質(zhì)中，其功能可以通過多位點激酶介導(dǎo)的磷酸化調(diào)節(jié)。雖然PDCD4 誘導(dǎo)凋亡的確切機制有待闡明，但在腎IRI 誘導(dǎo)細胞凋亡中，PDCD4 可能起著關(guān)鍵作用。已經(jīng)證實PDCD4 可以激活效應(yīng)Caspase-3 而啟動凋亡［8］。miR-21 的抗凋亡作用部分通過其靶基因PDCD4 等介導(dǎo)。miR-21 過度表達通過直接靶向3'-UTR 區(qū)而降低PDCD4 啟動子激活［9］。在腎缺血預(yù)處理研究中，升高miR-21 表達可降低PDCD4 表達，從而減少腎細胞凋亡；抑制miR-21 表達后，這種缺血預(yù)處理的腎保護作用被削弱［10］。本研究首先從細胞凋亡角度探討miR-21 減輕腎小管上皮細胞H/R 損傷的機制。pre-miR-21可以通過降低PDCD4 表達，下調(diào)Caspase-3 蛋白表達，抑制細胞凋亡。

腎細胞氧化應(yīng)激是IRI 的主要因素之一。多項研究表明，氧自由基（ROS）是腎IRI 的主要觸發(fā)因子，抑制腎細胞氧化應(yīng)激可以改善缺血后的腎功能［11］。miR-21 可通過降低 ROS 水平，抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的糖尿病傷口的炎癥惡化，抑制心肌細胞凋亡［12］。然而，miR-21 對腎 IRI 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的影響未見相關(guān)報道。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用pre-miR-21 預(yù)處理后，H/R 損傷的腎小管上皮細胞SOD、GSH、CAT 水平升高，TAC 明顯增加。這表明miR-21 可以減輕腎小管上皮細胞H/R誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。

炎癥反應(yīng)是腎IRI 的另外一個觸發(fā)因素。IRI可增加器官局部或全身的前炎癥細胞因子釋放，從而加重器官損傷。抑制腎缺血誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可以減輕腎 IRI［13］。體內(nèi)和體外實驗均表明，miR-21 可以調(diào)控IRI 過程中多種重要的前炎癥細胞因子的分泌［7，14］。但 miR-21 調(diào)控腎 IRI 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的研究比較少。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用pre-miR-21 預(yù)處理后的腎小管上皮細胞 H/R 損傷后，TNF-α 和 IL-6 水平降低。這表明miR-21 可以減輕腎小管上皮細胞H/R損傷誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

miR-21 對腎小管上皮細胞H/R 損傷后的作用機制不僅局限于調(diào)控細胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥，可能還涉及其他復(fù)雜機制，在今后的研究中將進一步探索與證實。而且，本研究只進行了體外細胞實驗，有待于在體內(nèi)實驗中進一步探討。