紅景天苷抑制淀粉樣β蛋白聚集和降低其細胞毒性的研究

郝斯佳，韓愛玲，楊亞瑜，方國臻，劉繼鋒*，王碩，2*

（1.天津科技大學食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津 300457；2.南開大學醫(yī)學院，天津 300071）

多酚化合物具有很強的緩解神經(jīng)毒性和抑制神經(jīng)退行性疾病的潛力[1-2]。近年來，一些研究表明，膳食多酚與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的嚴重并發(fā)癥呈負相關(guān)，并在一些治療中起到積極的作用，可以減輕這類疾病帶來的有害影響[3-4]。神經(jīng)疾病的病理復雜，發(fā)病誘因不完全清楚，市面上現(xiàn)有的藥物尚不能根治這類疾病，只能在一定程度上起到緩解作用[5]。人體組織中淀粉樣蛋白的形成和沉積在病理上與許多蛋白質(zhì)錯誤折疊疾病呈正相關(guān)，例如阿爾茲海默癥[6-7]。阿爾茲海默癥是老年癡呆最常見的一種形式，其病理特征是患者大腦中細胞內(nèi)tau蛋白神經(jīng)纖維纏結(jié)和細胞外β-淀粉樣蛋白（amyloid β-peptide，Aβ）聚集形成老年斑[8]。Aβ是由β和γ分泌酶連續(xù)切割淀粉樣前體蛋白而產(chǎn)生的，一般包含39個～43個氨基酸，Aβ40和Aβ42是最常見的兩種結(jié)構(gòu)，Aβ40約占總量的90%且容易聚集成纖維，而Aβ42則具有較高的毒性[9]。很多研究表明，阿爾茲海默癥患者大腦中Aβ聚集形成富含β-折疊結(jié)構(gòu)的纖維與發(fā)病機制密切相關(guān)[10-11]。所以，開發(fā)一種抑制劑在早期階段抑制Aβ聚集是治療和防治阿爾茲海默癥的潛在治療策略。

紅景天苷是從紅景天的根中提取出來的有效成分，在亞洲國家的傳統(tǒng)民間醫(yī)藥中被廣泛應用。紅景天苷因其多種功能特性而被廣泛應用于抗氧化、抗凋亡、抗腫瘤、抗疲勞、抗抑郁和保護肝臟等，越來越多的研究指出，紅景天苷還對大腦的神經(jīng)損傷具有保護作用，也能保護神經(jīng)元免受谷氨酸誘導的氧化應激和凋亡[12-15]。Zhang等[16]研究表明，紅景天苷可以通過限制通路來抑制細胞焦亡從而實現(xiàn)對多巴胺神經(jīng)元的保護，最后起到延緩帕金森疾病的作用。Wang等[17]研究表明，紅景天苷對阿爾茲海默癥模型小鼠受損的神經(jīng)元突觸具有保護作用。Li等[18]研究表明，紅景天苷通過調(diào)節(jié)PKC/p38MAPK通路來實現(xiàn)對阿爾茲海默癥模型小鼠神經(jīng)的保護作用。雖然紅景天苷已被證明對認知障礙具有一定的調(diào)節(jié)作用，但是尚沒有詳細的紅景天苷對Aβ40早期聚集的影響和對其誘導的細胞毒性的緩解作用的研究。

在本文中，采用ThT熒光、剛果紅和透射電子顯微鏡試驗考察紅景天苷對Aβ40纖維形成的抑制作用。利用圓二色譜試驗研究紅景天苷對Aβ40構(gòu)象轉(zhuǎn)變的影響，3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑鹽 [3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]試驗檢測紅景天苷的毒性和對Aβ40誘導的細胞毒性的緩解作用，最后利用分子對接試驗模擬紅景天苷和Aβ40的結(jié)合位置，簡要地分析抑制原理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-淀粉樣蛋白 40（amyloid β-peptide 40，Aβ40）（人源）：美國APExBIO科技有限責任公司；紅景天苷（salidroside，Sal）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（≥99.8%）、六氟異丙醇（≥99%）、硫黃素T（thioflavin T，ThT）（≥95%）、磷鎢酸（≥99%）：美國Sigma-Aldrich公司；PC12細胞：中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶消化液、青鏈霉素（雙抗）：美國GIBCO公司；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.4）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

熒光分光光度計（F-2500）：日本Hitachi集團；恒溫搖床（THZ-103B）：上海一恒科學儀器有限公司；酶標儀（Bio-RAD）：美國伯樂公司；圓二色譜儀（MOS-450）：法國 Bio-logic公司；超凈工作臺（BSC-1300IIB2）：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；細胞培養(yǎng)箱（Forma371）：美國 Thermo Scientific公司；高壓滅菌鍋（VB-40）：德國SYSTEC公司。

1.3 方法

1.3.1 Aβ40的制備

稱取適量的Aβ40溶解于六氟異丙醇中，配制成濃度為1 mg/mL的溶液，然后置于冰浴中超聲1 h除去預先存在的Aβ40聚集體，再置于冰浴中靜置2 h使其充分溶解，然后將溶液在4℃、15 000×g的條件下冷凍離心0.5 h[6]。離心完成后，吸取約80%的上清液于離心管中，每個離心管中加入100 μL，并用氮氣吹干，即可得到一層附著在離心管內(nèi)壁的蛋白質(zhì)薄膜，冷藏在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 ThT熒光試驗

以ThT熒光強度為指標考察紅景天苷的抑制作用。首先，用微量的二甲基亞砜溶解1.3.1制備好的蛋白質(zhì)薄膜，超聲10 min后，用PBS（pH 7.4）稀釋至0.4×10-4mol/L。試驗過程中將適當濃度的紅景天苷與Aβ40混合，在37℃、170 r/min條件下振蕩培養(yǎng)。反應結(jié)束后取出樣品，加入一定量的ThT溶液孵育10 min，測定其熒光強度。調(diào)節(jié)儀器參數(shù)：λEX為445 nm，λEM為460 nm～600 nm，狹縫寬度5nm。設定僅含Aβ40的樣品溶液為100%對照組，每個試驗重復測量3次，計算平均值繪制ThT熒光強度隨紅景天苷濃度變化的曲線圖。

1.3.3 剛果紅試驗

利用 PBS（2.5×10-2mol/L，pH7.4）配制濃度為 2.5 ×10-5mol/L的剛果紅（Congo red，CR）溶液，注意避光且現(xiàn)用現(xiàn)配。試驗過程中將適當濃度的紅景天苷與Aβ40混合，在37℃、170 r/min條件下振蕩培養(yǎng)。反應結(jié)束后取出樣品與剛果紅溶液混合，在室溫25℃下避光放置0.5 h，采用紫外分光光度計測定，波長范圍為400 nm～600 nm的吸光度。

1.3.4 透射電鏡試驗

采用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）考察Aβ40聚集體形態(tài)的變化。吸取反應一定時間的樣品溶液，滴于碳膜包裹的超薄銅網(wǎng)上，自然風干后，再利用等體積的2%的磷鎢酸染色1.5 min，染色結(jié)束后除去染料再用超純水洗滌3次，即可以進行觀察。

1.3.5 圓二色譜試驗

采用圓二色光譜（circular dichroism，CD）考察紅景天苷對Aβ40二級結(jié)構(gòu)的影響。分別吸取300 μL反應一定時間的Aβ40、Aβ40和紅景天苷共同孵育的樣品，置于1 mm厚的石英比色皿中，在室溫25℃下，以溶劑作為空白，在波長190nm～260nm、掃描速度30nm/min、掃描帶寬1 nm的條件下進行試驗以確定樣品二級結(jié)構(gòu)的變化，每次試驗重復3次取平均值。

1.3.6 細胞毒性試驗

采用細胞毒性試驗考察紅景天苷的細胞毒性及對Aβ40細胞毒性的影響，本研究采用MTT檢測法，使用的細胞為神經(jīng)元細胞系PC12細胞[19]。使用的培養(yǎng)基為DMEM高糖培養(yǎng)基[含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和100 U/mL青鏈霉素]。試驗首先將細胞培養(yǎng)至對數(shù)期備用。吸取180 μL密度為5×103/孔的細胞懸液于96孔板中，置于溫度為37℃，二氧化碳濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞貼壁。細胞貼壁后，再加入用培養(yǎng)基溶解好的紅景天苷溶液、Aβ40、紅景天苷與Aβ40共培養(yǎng)的混合溶液，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后緩慢吸出培養(yǎng)液，再快速加入90 μL新鮮的培養(yǎng)基和10 μL MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h。反應結(jié)束后離心吸出上清液，再加入110 μL甲臜（Formazan）溶液裂解沉淀的細胞，避光孵育10 min待紫色結(jié)晶物完全消失，用酶標儀測定吸光度，調(diào)節(jié)參數(shù)為490 nm，根據(jù)測定值計算細胞活性。試驗設置對照組和空白組，其中空白組不含細胞，對照組僅含細胞，每個待測物的濃度設置6個復孔，計算公式如下。

1.3.7 分子對接試驗

本試驗選用的Aβ40結(jié)構(gòu)來自蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（protein data bank，PDB），序列號為 1BA4[20]。紅景天苷的結(jié)構(gòu)由Gaussian繪制，且通過分子動力學和分子力學優(yōu)化出其最優(yōu)構(gòu)型。試驗過程中，首先用AutodockTools 1.5.6導出Aβ40和紅景天苷的PDBQT文件。選用半柔性對接完成本次試驗，設置Aβ40為剛性分子，配體（紅景天苷）為柔性分子，調(diào)節(jié)盒子（Box）大小且保證Box的體積足夠大，可以完全包裹Aβ40和配體分子。遺傳算法為Lamarckian，運行次數(shù)為100次。對接結(jié)束后，選取結(jié)合能最低的組，利用pyMOL軟件繪制圖像進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均平行測定3次，然后利用Origin 8軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅景天苷對Aβ40聚集的抑制作用

首先利用ThT熒光試驗來考察紅景天苷對Aβ40聚集的抑制作用，ThT是檢測纖維最常用的染料，當與纖維結(jié)合時，該染料激發(fā)和發(fā)射波長都會改變，且形成的纖維量越多，溶液的熒光強度越大。本試驗中纖維生成的量用ThT熒光強度來表示，結(jié)果見圖1。

圖1 紅景天苷對Aβ40聚集的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of salidroside on aggregation of Aβ40

如圖1 A所示，在僅存紅景天苷的條件下，ThT的熒光曲線幾乎沒有變化，這表明紅景天苷對ThT熒光強度幾乎無影響，不會影響后續(xù)的熒光檢測試驗。

考察紅景天苷（0.2×10-4、0.4×10-4、0.8×10-4、1.2×10-4、1.6×10-4、2.0×10-4mol/L）對 Aβ40（0.4×10-4mol/L）聚集的抑制作用，其中Aβ40獨自孵育24 h的熒光強度設定為100%，對其它的熒光值進行歸一化，繪制柱狀圖，結(jié)果如圖1 B。從圖1 B可以看出，紅景天苷以濃度依賴方式抑制Aβ40的聚集，當紅景天苷的濃度為2.0×10-4mol/L 時，ThT熒光強度降低了約（61.86±0.96）%。結(jié)果表明，紅景天苷對Aβ40的纖維化具有較強的抑制作用，而且紅景天苷濃度越大，對Aβ40纖維化的抑制作用越強。

利用剛果紅來考察紅景天苷對Aβ40聚集的抑制能力，剛果紅是一種常用的檢測纖維是否形成的染料。剛果紅對纖維具有較高的親和力，且剛果紅與原纖維的相互作用可導致其吸光度顯著增加，而且也會使吸收波長造成紅移。紅景天苷、Aβ40與紅景天苷混合溶液的剛果紅吸收光譜見圖2。

圖2 Aβ40與紅景天苷混合溶液的剛果紅吸收光譜Fig.2 Congo red binding spectra of Aβ40 and salidroside mixed solution

從圖2可以看出，在孵育24 h后，與剛果紅樣品相比，形成的Aβ40纖維使剛果紅的吸光度明顯增加，且最大吸光度波長發(fā)生明顯的紅移，表明淀粉樣纖維已經(jīng)形成。而不同濃度的紅景天苷與Aβ40共同反應的樣品溶液，其吸光度和紅移程度則有所減少，由圖2可知，紅景天苷以濃度依賴方式抑制Aβ40的聚集，當紅景天苷濃度為2.0×10-4mol/L時，剛果紅的吸光度最小，發(fā)生紅移的程度也最低，這與ThT熒光試驗的結(jié)果一致，表明紅景天苷可以有效抑制Aβ40聚集。

2.2 紅景天苷對Aβ40聚集形態(tài)的影響

利用TEM進一步考察紅景天苷對Aβ40聚集形貌的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 紅景天苷對Aβ40纖維形貌的影響Fig.3 Effect of salidroside on morphology of Aβ40 fiber

由圖 3可知，Aβ40（0.4×10-4mol/L）獨自孵育 24 h，形成典型的長且相互纏繞的纖維束（數(shù)百納米長，幾十納米寬）。相比之下，在Aβ40溶液中添加紅景天苷（2.0×10-4mol/L）孵育24 h后，只觀察到少量短而薄的纖維，以及一些無特定結(jié)構(gòu)的無定形聚集物。試驗結(jié)果表明，紅景天苷可以有效地延緩Aβ40原纖維的形成。這與ThT熒光和剛果紅結(jié)果一致，TEM和熒光試驗結(jié)果均證實紅景天苷能有效抑制Aβ40聚集，且可以明顯改變成熟纖維的形貌。

2.3 紅景天苷對Aβ40二級結(jié)構(gòu)的影響

利用遠紫外CD光譜考察紅景天苷對Aβ40聚集過程中構(gòu)象轉(zhuǎn)變的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 紅景天苷對Aβ40構(gòu)象的影響Fig.4 Effect of salidroside on the conformation of Aβ40

由圖4可知，紅景天苷在單獨孵育0 h或24 h后均不具有圓二色信號（圖4B），說明紅景天苷在溶液中很難形成明顯的二級結(jié)構(gòu)，因此不會對后續(xù)試驗造成干擾。而Aβ40的初始結(jié)構(gòu)為無規(guī)則卷曲，其特征為在196 nm處有一個負峰（圖4A黑線）[21]。孵育24 h后，這個峰值消失，與此同時，在195 nm處出現(xiàn)了一個正峰，217 nm處出現(xiàn)了一個負峰（圖4A藍線）。這表明Aβ40的二級結(jié)構(gòu)經(jīng)歷了由初始的無規(guī)則卷曲到β-折疊結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變[22-23]。紅景天苷與Aβ40共孵育的混合溶液經(jīng)歷了相似的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，即從無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊結(jié)構(gòu)。不同的是，與Aβ40單獨孵育24 h相比，紅景天苷共孵育的Aβ40，其整體CD信號明顯下降（圖4A綠線）。結(jié)果表明，紅景天苷的加入使Aβ40的β-折疊含量明顯降低，這表明紅景天苷具有抑制能力，能夠干擾Aβ40從無規(guī)則卷曲向β-折疊的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，從而抑制纖維的形成。CD光譜的變化與Aβ40聚集的熒光和TEM數(shù)據(jù)一致。

2.4 紅景天苷的細胞毒性和對Aβ40誘導的細胞毒性的影響

以PC12細胞為試驗對象，采用MTT法研究了紅景天苷的細胞毒性和對Aβ40成熟纖維誘導的細胞毒性的保護作用，結(jié)果見圖5。

圖5 紅景天苷對PC12細胞活力的影響和對Aβ40誘導的細胞毒性的保護作用Fig.5 The influences of salidroside on the cell viability of PC12 and the protective effects to Aβ40-induced cytotoxicity toward PC12 cells

設定沒有Aβ40或紅景天苷的PC12細胞的強度為100%，對所有MTT吸光度信號進行歸一化。首先研究紅景天苷對PC12細胞的影響，如圖5A所示，添加不同濃度的紅景天苷后細胞活力均低于對照組，說明紅景天苷本身對PC12細胞有一定的毒性，且呈劑量依賴性。然而，紅景天苷對PC12細胞的細胞毒性不顯著，經(jīng)過2.0×10-4mol/L紅景天苷處理過的PC12細胞，其細胞活力仍可達到（82.03±0.56）%，而 0.2×10-4mol/L紅景天苷處理PC12細胞的細胞活力可達到（91.10±2.05）%。

研究紅景天苷對Aβ40誘導的細胞毒性的保護作用，如圖5B所示，PC12細胞與Aβ40聚集物共孵育24 h后，具有較強的細胞毒性，使細胞活力下降至（46.67±1.70）%。相比之下，在不同濃度紅景天苷的保護下，Aβ40的細胞活力逐漸增強。當紅景天苷的濃度為0.2×10-4mol/L時，細胞的保護能力不明顯，細胞活力為（62.32±2.74）%。當濃度增加到 1.6×10-4mol/L和2.0×10-4mol/L 時，細胞活力分別提高到（76.68±0.24）%和（80.89±1.23）%。總的來說，高濃度紅景天苷可以明顯提高細胞活力，證實了紅景天苷抑制與其濃度呈正相關(guān)。根據(jù)聚集熒光試驗（ThT、剛果紅）和結(jié)構(gòu)表征（TEM、CD）結(jié)果，紅景天苷可以將Aβ40纖維重塑為無定型的聚集物，且神經(jīng)毒性更低。當濃度為2.0×10-4mol/L時，對細胞的保護效果最好。

2.5 分子對接試驗

作為一種多酚，紅景天苷能發(fā)揮類似表沒食子兒茶素沒食子酸酯[（-）-epigallocatechin gallate），EGCG]的神經(jīng)保護作用，可與α-螺旋和β-片層之間的過渡性構(gòu)象β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)結(jié)合，從而使Aβ保持α-螺旋結(jié)構(gòu)。Aβ40結(jié)構(gòu)來源于蛋白質(zhì)庫，在這個模型中，16～24、25～27、28～40 位氨基酸形成 α-螺旋結(jié)構(gòu)，其余殘基形成無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)[20]，采用Aβ40的α-螺旋結(jié)構(gòu)進行對接分析。對接試驗是分子間相互作用的一個快照，以確定紅景天苷和Aβ40在原子水平上是否存在直接的相互作用。分子對接試驗結(jié)果見圖6。

圖6 分子對接試驗結(jié)果Fig.6 Molecular docking test results

如圖6 C所示，紅景天苷與Aβ40螺旋結(jié)構(gòu)的疏水表面匹配良好。紅景天苷的酚羥基與Aβ40的Asp1、Glu11、Lys16和Ser26形成氫鍵。結(jié)果表明，紅景天苷主要通過氫鍵與Aβ40相互作用。

綜上所述，紅景天苷可以明顯抑制Aβ40在生長期的纖維的生成，這一結(jié)果也說明，紅景天苷能夠與單體、中間產(chǎn)物或成熟纖維結(jié)合，從而干擾Aβ40的結(jié)構(gòu)從無規(guī)卷曲到β-折疊結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)換，或者其它單體與現(xiàn)有淀粉樣物質(zhì)結(jié)合形成大的聚集體。由于紅景天苷具有與其它典型的Aβ40抑制劑相似的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，可能與Aβ40的芳香殘基相互作用，在紅景天苷和Aβ40之間形成π-π堆疊作用。此外，紅景天苷的平面構(gòu)象可能還提供了與淀粉樣纖維疏水區(qū)域折角結(jié)構(gòu)匹配的構(gòu)型，使紅景天苷可以與淀粉樣纖維側(cè)鏈的β-片狀區(qū)域通過氫鍵連接。這些協(xié)同作用可能都在一定程度上起到了抑制Aβ40聚集的作用。

3 結(jié)論

本研究揭示了紅景天苷對Aβ40纖維聚集的抑制作用及相應的細胞毒性的緩解作用。ThT熒光、剛果紅和TEM試驗表明，紅景天苷可以有效地抑制Aβ40成熟纖維的形成，并呈劑量依賴的方式，即濃度越大，抑制效果越好。細胞毒性試驗結(jié)果表明，紅景天苷能保護PC12細胞免受Aβ40誘導的細胞毒性作用。CD試驗表明，紅景天苷可以有效地降低Aβ40的β-折疊結(jié)構(gòu)的含量。分子對接試驗結(jié)果表明，紅景天苷主要通過氫鍵與Aβ40結(jié)合，結(jié)合位置為Asp1、Glu11、Lys16和Ser26。因此，紅景天苷有很大的潛力發(fā)展為Aβ40聚集抑制劑和功能性食品成分，用于阿爾茲海默病的治療干預。