茯苓改善小鼠學習記憶功能作用的研究

馮敏，郟自明，萬鳴，樊柏林，唐曉蕎，程文華，孫凡中*

（1.湖北省疾病預防控制中心應用毒理湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430075；2.湖北省中醫院藥事部，湖北 武漢 430074）

學習和記憶是大腦重要的神經功能，《春秋緯元命苞》提到“腦之為言在也，人精在腦”，即人之精明是因為腦具有學習記憶功能[1]。阿爾茲海默癥和腦外傷被認為是導致學習記憶功能障礙的主要原因，隨著人口老齡化進程加快和環境的逐漸惡化，中樞神經退行性疾病發病率逐年升高，因其發病原因多樣且機制復雜，單純的西藥干預較難取得顯著的治療效果。因此，從傳統中藥中尋找有效成分，利用其天然營養價值，開發相關食品成為研究熱點。茯苓是我國傳統中藥“四君八珍”之一，為多孔菌科真菌茯苓[Poria cocos（Schw.）Wolf]的干燥菌核，具有利水滲濕、健脾胃、寧心安神的功效。大量研究表明[2-4]，茯苓還具有抗炎、保肝、增強免疫力等作用，不同部位提取物因其化學成分不同，功效也存在差異。目前，茯苓多與其它中草藥配伍，以發揮改善學習記憶能力的作用，李牧函等[5]研究發現，以茯苓為主要成分的開心散具有改善阿爾茲海默癥小鼠學習記憶能力的作用。同時，金蘋等[6]研究發現，磷脂酰絲氨酸/茯苓組合可通過保護神經元途徑改善學習記憶能力。然而，因方劑成分復雜，功效往往不太穩定，成分單一的單味茯苓功效可能更佳，但單味茯苓及其不同方式提取物對學習記憶功能的改善作用目前鮮有報道。茯苓屬于兼性寄生菌，茯苓菌生長依賴松木提供養分，傳統的種植方法需要大量砍伐松樹作為材料，不利于環境保護。為了使環境免遭破壞，研發出一種不用松木栽培茯苓的新方法，即將植物秸稈或枝條粉碎后，與松木屑、米糠、蔗糖、熟石膏等混勻，模擬松木環境和營養成分，制成菌袋后接種茯苓菌種，該方法能在保護松林資源的同時縮短采收期，大大增加了茯苓的生產效率[7]。但以此方法生產的代培茯苓功效是否和傳統方式栽培的茯苓一致，還需要進一步研究比較。本研究通過水迷宮實驗、跳臺實驗和避暗實驗，探討生茯苓粉、熟茯苓粉、茯苓代培粉、茯苓水提物以及茯苓醇提物對小鼠學習記憶功能的改善作用，旨在為使用茯苓及其不同方式提取物開發相關食品及藥品提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

130只SPF級昆明種雌性小鼠，18 g～22 g，由湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號：SCXK（鄂）2020-0018，實驗動物質量合格證號：No.42000600035140。動物飼養于屏障系統的獨立通氣籠具（individual ventilated cages，IVC）中，于恒溫恒濕（溫度 20℃～25℃、濕度40%～70%）環境下，12 h明暗交替飼養。

1.2 原料及試劑

茯苓（批號：20171028）：市售，由湖北省中醫院中藥新藥研發中心萬鳴副研究員鑒定、提取。茯苓樣品包括生茯苓粉（批號20171101-1）、熟茯苓粉（批號20171101-2）、茯苓代培粉（批號 20181010）、茯苓水提物（批號20180712，提取得率2.8%）、茯苓醇提物（批號20180715，提取得率1.7%）；羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 儀器與設備

ZH-1型自動記錄水迷宮、ZH-600型小鼠避暗儀、YLS-3TB型跳臺記錄儀：安徽省淮北市正華生物儀器設備有限公司。

1.4 方法

1.4.1 分組及給藥

將130只小鼠隨機分為13組，每組10只，即陰性對照組，生茯苓粉低、高劑量組，熟茯苓粉低、高劑量組，茯苓代培粉低、高劑量組，茯苓水提物低、中、高劑量組，茯苓醇提物低、中、高劑量組。依據茯苓的人群推薦生藥量10 g/（人·d），按體表面積換算動物等效劑量，小鼠等效劑量為1.3 g/（kg·d）。設置茯苓粉低、高劑量組小鼠給藥劑量分別為0.13、4.00 g/kg，茯苓水提物低、中、高劑量組小鼠的給藥劑量分別為0.04、0.12、0.36 g/kg，茯苓醇提物低、中、高劑量組小鼠的給藥劑量分別為0.02、0.06、0.18 g/kg。陰性對照組給予等體積的0.5%CMC。每天灌胃給藥1次，連續30 d。

1.4.2 水迷宮實驗

參考文獻[8]的方法，于末次給藥次日開始訓練，第一次訓練使小鼠自動爬梯3次，以后每次訓練使小鼠背朝樓梯，自動爬梯1次，根據小鼠學習成績，逐步加長路程。第一次訓練從A點開始，記錄小鼠從A點到達終點的時間；第二次訓練從B點開始，加長路程，訓練3次至80%以上動物在2 min內達到終點后，繼續延長路程，分別記錄各小鼠每次從B點到達終點所需時間和發生錯誤的次數（進入任何一個盲端一次均算一次錯誤）；末次測試從起點進行，記錄從起點到達終點所需的時間和發生錯誤的次數。為達到訓練目的，應引導2 min內未完成訓練的小鼠到達終點。每次訓練或測驗時各小鼠頭朝起始點，最后計算各組小鼠5次訓練和測試的總錯誤次數，到達終點的總時間及2 min內到達終點的總小鼠數（2 min內到達終點的小鼠數占該組小鼠總數的百分率），停止訓練5 d后（包括第5天），于不同時間從起點進行記憶消退實驗。

1.4.3 跳臺實驗

參考文獻[8]的方法，于末次給藥次日開始訓練，將小鼠放入反應箱內銅柵上，立即通以36 V的交流電使小鼠受到電擊，記錄5 min內各小鼠跳下平臺的錯誤次數和第一次跳下平臺的潛伏期，以此作為學習成績。24 h后開始測驗，記錄各小鼠第一次跳下平臺的潛伏期、3 min內電擊次數以及受電擊的小鼠總數，同時計算出現錯誤反應小鼠的百分率（受電擊的小鼠數占該組小鼠總數的百分率）。停止訓練5 d后（包括第5天）進行一次記憶消退實驗。

1.4.4 避暗實驗

參考文獻[8]的方法，于末次給藥次日開始訓練，將小鼠背向洞口放入明室，同時啟動計時器，小鼠穿過洞口進入暗室受到電擊，計時器自動停止，記錄各小鼠從放入明室至遭電擊所需的時間，記為潛伏期，訓練5 min，并記錄5 min內電擊次數。24 h后開始測驗，記錄每只小鼠進入暗室的潛伏期和5 min內的電擊次數，并計算5 min內進入暗室（錯誤反應）的小鼠百分率（進入暗室的小鼠數占該組小鼠總數的百分率）。停止訓練5 d后（包括第5天）進行一次記憶消退實驗。

1.5 統計方法

采用SPSS20.0軟件分析數據，結果用平均值±標準差表示。各組數據均采用單因素方差分析（one-way analysis of variance，one-way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 水迷宮實驗結果

水迷宮實驗中，茯苓對小鼠記憶獲得的影響見表1、表 2。

表1 茯苓對水迷宮實驗小鼠記憶獲得影響Table 1 Effect of Poria cocos on memory acquisition of mice in water maze experiment

續表1 茯苓對水迷宮實驗小鼠記憶獲得影響Continue table 1 Effect of Poria cocos on memory acquisition of mice in water maze experiment

表2 茯苓對水迷宮實驗小鼠記憶消退的影響Table 2 Effect of Poria cocos on memory loss of mice in water maze experiment

由表1和表2可知，記憶獲得期和記憶消退期各組小鼠到達終點的時間與陰性對照組比較均無顯著差異；部分茯苓組小鼠記憶獲得期到達終點前錯誤次數與陰性對照組比較顯著增加（P<0.05），而記憶消退期均無顯著差異；部分茯苓組小鼠記憶獲得期2 min內到達終點的小鼠數與陰性對照組比較顯著增加（P<0.05），以上結果說明茯苓對小鼠的學習記憶能力有一定的改善作用，但若需更顯著的效果出現，可能還需更長時間的干預。

2.2 跳臺實驗結果

跳臺實驗中，茯苓對小鼠記憶的影響結果見表3～表5。

表3 茯苓對跳臺實驗訓練期小鼠記憶的影響Table 3 Effect of Poria cocos on memory of training mice in diving platform experiment

表4 茯苓對跳臺實驗測驗期小鼠記憶的影響Table 4 Effect of Poria cocos on memory of mice in the test period of the diving platform experiment

表5 茯苓對跳臺實驗小鼠記憶消退的影響Table 5 Effect of Poria cocos on memory loss of mice in diving platform experiment

由表3～表5可知，茯苓組各組小鼠訓練期的潛伏期與陰性對照組比較均縮短，錯誤次數與錯誤反應率無顯著差異；部分茯苓組小鼠測驗期和記憶消退期錯誤反應率顯著降低（P＜0.01），潛伏期和錯誤次數無明顯改善。以上結果說明茯苓對小鼠的學習記憶能力有一定的改善作用，但與其提取方式和劑量相關。其中生茯苓粉高劑量組、熟茯苓粉高劑量組可顯著降低測驗期錯誤反應率，效果較佳；生茯苓粉高劑量組、熟茯苓粉各劑量組、茯苓代培粉高劑量組、茯苓水提物中劑量組可顯著降低記憶消退錯誤反應率，生茯苓粉高劑量組和茯苓代培粉高劑量組小鼠記憶消退潛伏期顯著延長。但這些茯苓組對學習記憶能力的改善要出現顯著差異，需進行更長時間的干預。

2.3 避暗實驗結果

避暗實驗中，茯苓對小鼠記憶的影響結果見表6～表8。

表6 茯苓對避暗實驗訓練期小鼠記憶的影響Table 6 Effect of Poria cocos on memory of training mice in avoid dark experiment

表7 茯苓對避暗實驗測驗期小鼠記憶的影響Table 7 Effect of Poria cocos on memory of mice in the test period of the avoid dark experiment

表8 茯苓對避暗實驗小鼠記憶消退的影響Table 8 Effect of Poria cocos on memory loss of mice in avoid dark experiment

由表6～表8可知，茯苓代培粉低劑量組、茯苓醇提物低劑量組的測驗期錯誤反應率與陰性對照組相比顯著降低（P＜0.05），但記憶消退期各茯苓組錯誤反應率均顯著升高（P＜0.05），說明茯苓可在一定時間和劑量范圍內發揮顯著作用，隨著干預時間的延長會逐漸失去功效，可能與其毒理作用的表現有關。

3 討論

根據茯苓的藥理特性，分析其改善學習記憶功能的作用機制可能有以下兩個方面：一方面可以調控中樞膽堿能神經系統。有研究表明[9-10]，茯苓可有效降低大腦乙酰膽堿酯酶（acetyl cholinesterase，AchE）活性，提高小鼠腦指數，從而改善學習記憶能力。乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）參與協調大腦皮層情緒和運動等功能，是中樞神經中重要的神經遞質，影響著機體的學習和認知能力，AchE通過水解ACh控制膽堿神經元突觸間的信息傳遞，進而調控腦功能[11]。另一方面抑制過氧應激反應。Benzi等[12]研究發現，過氧化應激增強是導致老年癡呆癥的重要原因。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）控制著機體氧化與抗氧化平衡，丙二醛（malondialdehyde，MDA）活性的高低可以反映機體內氧自由基水平和細胞損傷程度，茯苓可通過提高SOD活性降低MDA活性，加速清除體內自由基，從而減少過氧應激反應對機體的損傷，改善學習記憶能力[13]。

4 結論

本研究結果表明，生茯苓粉、熟茯苓粉、茯苓代培粉、茯苓水提物以及茯苓醇提物均具有改善小鼠學習記憶功能的作用，其中茯苓代培粉既可增強水迷宮實驗中小鼠記憶獲得能力，又可降低跳臺實驗中小鼠錯誤反應率、延長記憶消退潛伏期，還能降低避暗實驗中小鼠錯誤反應率，其對小鼠的學習記憶功能改善作用最佳。綜上所述，茯苓具有改善小鼠學習記憶功能的作用，其機制可能與調控中樞膽堿能神經系統和抑制過氧應激反應有關，以茯苓為主要成分開發食品或藥品，將在預防中樞神經退行性疾病領域具有較大的社會價值。