太子參提取物抗氧化能力的比較研究

孔鈺婷，何洪，安鳳平，2*，林余鵬，宋洪波，2，黃群，2

（1.福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002；2.福建省特種淀粉品質科學與加工技術重點實驗室，福建 福州 350002）

太子參為石竹科植物孩兒參的干燥塊根，在福建、山東、江蘇、安徽、貴州等地均有種植。太子參已列入可用于保健食品的名單中，具有益氣健脾、生津潤肺的功效，廣泛用于治療各種疾病，如心絞痛、糖尿病、肺燥干咳等[1-3]。太子參的功能性研究成為關注的熱點。有研究表明，太子參水提物和醇提物都具有很好的抗氧化活性，能清除·OH，提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活力。試驗還表明，太子參醇提取物的抗脂質過氧化活性強于水提取物[3]。但太子參醇提取方法以及提取物組成與抗氧化能力的關系尚不明晰。

本研究以柘榮太子參為原料，探究不同濃度乙醇的提取物抗氧化能力，進而對比研究初步純化對提取物組成和抗氧化能力的影響，通過體外模擬消化考察組分穩定性并評價其抗氧化能力，為利用太子參開發抗氧化功能食品提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柘榮太子參：福建咸康藥業有限公司，粉碎后過40目篩備用。

VC（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；人參皂苷Rb1標準品（色譜純)：安徽西青果生物科技有限公司；蘆丁（分析純）、葡萄糖（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；香草醛（分析純）、ABTS（分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；DPPH（分析純）、胃蛋白酶（30 000 U/mg）、胰蛋白酶（2 500 U/mg）、豬膽鹽（膽酸含量≥60%）：上海源葉生物科技有限公司；D101大孔樹脂（分析純）：艾美科健（中國）生物醫藥有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1780紫外分光光度計、Nexera UHPLC LC-30A超高效液相色譜儀：日本島津公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；N-1100旋轉蒸發儀、FDU-1200冷凍干燥機：上海愛朗儀器有限公司；MS 3渦旋振蕩器：德國IKA公司；Heraeus Fresco17離心機：美國Thermo Fisher Scientific公司；SpectraMax PLUS酶標儀：美國Molecular Devices公司；Triple TOF 5600高分辨質譜儀：美國AB Sciex公司；ACQUITY UPLC BEH色譜柱：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 太子參提取物的制備

分別以0%、30%、50%、70%、90%乙醇為溶劑，將太子參粉按料液比為1∶8（g/mL），以60℃回流提取2次，每次1 h，合并兩次濾液于50℃旋蒸濃縮至1/4，冷凍干燥得粉末，為粗提物，分別命名為T0、T30、T50、T70和T90。

將30%乙醇提取并濃縮的液體用石油醚萃取后旋蒸去除石油醚，用水補足體積，稀釋8倍過濾后上大孔樹脂D101，水洗至Molish反應至陰性，用30%、50%、70%、90%乙醇梯度洗脫，收集洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥得粉末，為初步純化物（洗脫物），分別命名為X30、X50、X70 和 X90。

1.3.2 總糖、黃酮和皂苷含量的測定

1.3.2.1 總糖含量的測定

采用苯酚-濃硫酸法[4]。取1 mL樣品溶液，加5%苯酚1 mL，混勻后加5 mL濃硫酸，混勻，室溫（26℃）避光反應30 min后于490 nm處測定吸光度。以葡萄糖為標品，繪制標準曲線。

1.3.2.2 黃酮含量的測定

參考Pitura等[5]的方法測定。取0.5 mL樣品溶液于10 mL容量瓶中，加入1.5 mL蒸餾水稀釋，加入5% NaNO20.3 mL后混勻，室溫（26℃）放置 5 min，加入0.6 mL 10% AlCl3溶液。6 min后加入2 mL的1 mol/L NaOH溶液，加蒸餾水至刻度，混勻后于510 nm處測定吸光度。以蘆丁為標準品，繪制標準曲線。

1.3.2.3 皂苷含量的測定

取適量樣品溶液于10 mL具塞試管中，60℃水浴揮干溶劑，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸，混勻，水浴加熱15 min后冰水浴冷卻，加入5 mL冰醋酸，搖勻，于560 nm波長處測定吸光度。以人參皂苷Rb1為標準品，繪制標準曲線[6]。

1.3.3 抗氧化能力的測定

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力

在 20 μL樣品溶液中加入 180 μL DPPH溶液（0.1 mmol/L），振蕩混勻后室溫（26℃）下避光反應30 min，用酶標儀于517 nm處測吸光度。同時采用VC作為陽性對照，清除率計算見公式（1）[7]。

式中：A0為空白對照的吸光度；A1為樣品與DPPH反應后的吸光度；A01為樣品自身的吸光度。

1.3.3.2 ABTS+自由基清除能力

參考Thaipong等[8]的方法，20mL7mmol/L的ABTS+溶液與350 μL 140 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合，于室溫（26℃）下避光反應14 h，制成ABTS+儲備液，用時將該儲備液稀釋至734 nm處吸光度為（0.7±0.005）。在20 μL不同濃度的樣品溶液中加入 180 μL ABTS+溶液，混勻后避光反應10 min，用酶標儀在734 nm處測定其吸光度，采用VC作為陽性對照。清除率計算見公式（2）。

式中：A0為空白對照的吸光度；A1為樣品與ABTS+溶液反應后的吸光度；A01為樣品自身的吸光度。

1.3.3.3 羥自由基清除能力

在2 mL不同濃度的樣品溶液中依次加入0.6 mL的6 mmol/L FeSO4溶液和0.6 mL的6 mmol/L H2O2溶液，混勻靜置反應10 min后加入0.6 mL的6 mmol/L水楊酸，搖勻靜置10min，于510nm波長處測定其吸光度。采用VC作為陽性對照，清除率計算見公式（3）[9]。

式中：A0為空白樣品的吸光度；A1為樣品與自由基反應后的吸光度；A2為無水乙醇代替水楊酸時的吸光度。

1.3.3.4 鐵離子抗氧化能力測定

配制鐵離子抗氧化能力（ferricionreducingantioxidant power，FRAP）工作液[300 mmol/L，pH3.6 的醋酸鹽緩沖溶液，10 mmol/L三吡啶基三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ]溶液和 20 mmol/L FeCl3溶液按體積比 10∶1∶1混合），取12 μL樣品與188 μL FRAP工作液混合，反應10 min后于593 nm下測定吸光度。以FeSO4為標準的回歸方程計算樣品的抗氧化能力，1 mmol/L FeSO4為1個FRAP值[10]。

1.3.4 體外模擬消化

體外模擬消化包括胃消化和腸消化。參照Minekus等[11]的方法配制胃液和腸液，胃液含有25 000 U/mL的豬胃蛋白酶，腸液中包含800 U/mL的胰蛋白酶和膽鹽。

體外模擬胃消化是將100 mg樣品加入至20 mL胃液中，置于37℃恒溫搖床，100 r/min消化2 h，分別在 0.5、1.0、1.5、2.0 h 取樣 5 mL，4 ℃、10 000 r/min 離心10 min，取上清液用于成分和抗氧化能力檢測。

將經胃液消化的樣品添加至20 mL腸液中，于恒溫振蕩器37℃、100 r/min 消化 2 h，分別在 0.5、1.0、1.5、2.0 h取樣5 mL，4℃、1 000 r/min離心10 min，取上清液用于成分及抗氧化能力檢測。

1.3.5 超高效液相色譜-串聯四極桿飛行時間質譜物質鑒定

稱取50mgX30，加入500 μL含有內標的甲醇溶液（80%甲醇，內標濃度 2 μg/mL），勻漿 4 min，冰水浴超聲處理1 h，-20℃靜置1 h；將樣本以4℃、12 000 r/min離心10 min，取出上清液過0.22 μm濾膜后于2 mL進樣瓶中上機檢測。

使用Waters的UPLC BEH C18色譜柱（1.7 μm×2.1 mm×100 mm），進樣體積為 5 μL，流速 0.4 mL/min。

利用質譜儀進行質譜分析，在軟件（Analyst TF 1.7，AB Sciex）控制下基于信息關聯數據采集（data independent acquisition，IDA）功能進行一級、二級質譜數據采集。使用Progenesis QI軟件將質譜原始數據導入，對含有MS/MS數據的峰進行物質鑒定。

1.3.6 數據處理

利用DPS 7.5軟件進行統計分析，3次重復測定結果以平均值±標準差表示。采用單因素方差分析并用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 體外抗氧化能力

2.1.1 粗提物體外抗氧化能力比較

粗提物體外抗氧化能力的比較結果詳見圖1。

圖1 太子參粗提物體外抗氧化能力比較Fig.1 In vitro antioxidant capacity of the Radix pseudostellariae extracts

由圖1可知，太子參粗提物的抗氧化活性隨其濃度增加而增強。從圖1（a）和圖1（b）可以看出，粗提物清除DPPH自由基和ABTS+自由基的效果均較VC弱；圖1（c）表明粗提物對羥自由基具有較好的清除能力，有文獻報道太子參水提物在動物體內對羥自由基具有良好清除作用[12]；當濃度達到6 mg/mL時，除T90外，其余各粗提物對羥基自由基清除能力與VC相當，T90清除羥基自由基能力有所降低，原因可能是乙醇濃度過高會增加脂溶性物質的溶出[13]，該類物質對羥基自由基清除貢獻較小。圖1（d）的結果表明相同濃度時，T70的FRAP值最高，說明T70對鐵離子還原能力強于其它粗提物。

綜合各項抗氧化指標評價結果，各粗提物中T70表現出最強的抗氧化能力，因此采用T70過柱洗脫進一步研究抗氧化能力。

2.1.2 洗脫物體外抗氧化能力比較

各級洗脫物的體外抗氧化能力比較結果見圖2。

圖2 洗脫物體外抗氧化能力比較Fig.2 In vitro antioxidant capacity of the ethanol elutions

從圖2可以看出經大孔樹脂D101吸附后，乙醇梯度洗脫的各級洗脫物抗氧化能力均隨著濃度的增加而增強；相同濃度時，各級洗脫物抗氧化能力依次遞減，即 X30＞X50＞X70＞X90。在圖 2（a）～圖 2（c）中，X30濃度大于4 mg/mL時，清除ABTS+·、DPPH·和羥基自由基能力與VC差異不顯著，說明抗氧化效果與VC相當。從圖2（d）可以看出，盡管X30對鐵離子還原能力顯著低于VC，但顯著好于其它洗脫物。綜合而言，各級洗脫物中X30的抗氧化能力最強。

2.2 主要活性成分測定

太子參粗提物和洗脫物中主要活性物質含量見表1。

表1 太子參粗提物和洗脫物中總糖、皂苷、黃酮含量對比Table1 Comparison of total sugar，saponin and flavonoids in the extracts and the elutions of Radix pseudostellariae

如表1所示，不同濃度乙醇提取的太子參粗提物中總糖、皂苷和黃酮含量存在較大差異，其中糖類物質更容易被低濃度（30%）乙醇溶劑提取出來，70%乙醇更有利于皂苷和黃酮的溶出，進一步增加乙醇濃度則不利于皂苷和黃酮的溶出，說明主要成分的溶解性和選擇性與乙醇濃度有關。

由T70過大孔樹脂柱后不同濃度乙醇的洗脫物中總糖、皂苷和黃酮含量存在較大差異，其中X30中總糖、皂苷和黃酮含量均顯著大于較高濃度乙醇的洗脫物；與T70相比，X30中總糖含量較T70中明顯減少，而皂苷和黃酮含量則明顯增大。綜合上一節中X30的綜合抗氧化能力優于T70，由此說明太子參提取物中皂苷和黃酮含量是抗氧化能力關鍵成分。

2.3 體外模擬消化及抗氧化能力

進一步比較X30和T70中主要成分在體外模擬消化過程中穩定性以及所表現出的抗氧化能力，如圖3所示。

圖3 體外模擬消化過程中太子參醇粗提物和洗脫物組分的變化Fig.3 Component changes of the extract and the elution of Radix pseudostellariae during simulated digestion.

圖3（a）中T70中黃酮在胃液中消化曲線較平坦，說明胃酸對黃酮含量的影響較小；在腸消化階段，消化液中黃酮含量增加，這與陸俊等[14]的研究結果類似。據報道，類黃酮化合物在胃腸道消化液中降解極少[15]。X30中黃酮含量在整個胃腸消化過程均表現出比較穩定，可能是由于糖苷/糖苷配基比例的差異反映出糖苷穩定性的差異[16]。

圖3（b）表明X30和T70中皂苷含量在胃液中較穩定，在腸消化階段皂苷濃度大幅度下降，這是因為皂苷能與腸液中的膽汁鹽形成不可吸收的較大的聚集體[17]，從而導致皂苷含量下降。由此可見，太子參皂苷類化合物主要在腸道被消化。

從圖3（c）可以看出X30和T70中糖類物質在胃腸消化過程中含量逐漸減小，這是因為酸[18]和鹽[19]都會導致糖類物質的解離，胃腸液中的電解質（NaCl、KCl、NaHCO3、CaCl2等）都會對其穩定性產生影響[20]。

消化過程中活性成分的酶解和降解轉化，使得消化產物的抗氧化活性產生差異。如圖3（d）所示，X30和T70在胃液消化過程中抗氧化能力較好，在腸液消化過程中抗氧化能力有所降低；X30在消化過程中的抗氧化能力明顯強于T70，這些均是由其內在主要成分含量以及在消化系統中的穩定性所決定的。VC在胃腸消化過程中穩定性好；由于X30中主要成分含量高，其中的黃酮消化穩定好，盡管皂苷和糖的消化穩定性較差，仍具有較好的抗氧化能力。

2.4 成分鑒定

利用超高效液相色譜-串聯四極桿飛行時間質譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UHPLC-QTOFMS/MS）對太子參提取物中主要成分物質進行物質鑒定，得到的總離子流圖（total ion chromatography，TIC）圖譜如圖4所示。

圖4 UHPLC-QTOF-MS檢測正、負離子模式TIC圖Fig.4 TIC image of positive and negative ion modes detected by UHPLC-QTOF-MS

經鑒定，X30中皂苷類化合物主要為Sublateriol C和Laetiposide F，黃酮類化合物包括6，8-Di-C-beta-D-arabinopyranosylapigenin、Apigenin 8-C-[xylosyl-（1->2）-galactoside]、Isovitexin 2″-O-（6′″-（E）-pcouma-royl）glucoside、木犀草素、Kaempferol 3-（2G-xylosylrutinoside）-7-glucoside、Quercetin 3-rutinoside-7-（6″-benzoylglucoside）7-[（6-O-Benzoyl-beta-D-glucopyranosyl）oxy]-3-[[6-O-（6-deoxy-alpha-L-mannopyranosyl）-beta-D-glucopyranosyl]oxy]-2-（3，4-dihydroxyphenyl）-5-hydroxy-4H-1-benzopyran-4-one、6，8-Di-C-beta-D-arabinopyranosylapigenin、Apigenin 4′-glucuronide、Kaempferol 3-（3″-p-coumaroylrhamnoside）-7-rhamnoside，此外還含有三萜類物質鉤藤酸E、三萜皂苷元熊果酸等。

3 結論

經體外抗氧化評價體系篩選出70%乙醇粗提物的抗氧化性較好，經大孔樹脂D101富集純化后30%乙醇的洗脫物X30具有更好的抗氧化能力，較高濃度的X30抗氧化能力與VC相當。X30中黃酮含量為（129.977±2.226）（mg/g干物質），皂苷含量為（613.477±11.994）（mg/g干物質），表示皂苷和黃酮對抗氧化具有決定性作用；在胃腸消化過程中黃酮的穩定性好，皂苷、總糖含量的穩定性相對較差；X30在胃腸消化過程中仍具有較好的抗氧化性。明確了X30中皂苷類和黃酮類化合物的主要組成。因此，X30具有良好的抗氧化功能開發和應用潛力。