微波超聲協同提取金盞菊皂苷工藝及其抗氧化性研究

只德賢，覃海波，李建穎

（天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，國家級食品與藥品實驗教學示范中心，天津 300134）

金盞菊又名大金盞花、金盞花、山金菊等，為菊科植物金盞菊（Calendula officinalis L.）的干燥全草。其性寒、味苦，具有清熱解毒、涼血調經的作用。金盞菊原產于歐洲南部和埃及，現在世界各地均有分布，資源極其豐富，在我國亦有大量栽培。金盞菊應用廣泛，不僅可用于化學工業、化妝品行業，還可用于食品和醫藥行業。金盞菊早期用于治療靜脈曲張，外用治療褥瘡等皮膚病[1]。現代研究表明金盞菊不僅具有良好的抗氧化[2]、抗炎[3]、抗菌活性[4]，還具有降血糖[5]、保護腸黏膜[6]的作用。金盞菊提取物對皮膚有美白、保濕作用，能夠延緩皮膚老化[7]。MIGUEL等[8]研究顯示，金盞菊提取物對4種腫瘤細胞具有明顯的抑制作用；JADOON等[9]的研究表明含有金盞菊提取物的藥膏可減輕紫外線對皮膚造成的傷害；PREETHI等[10]研究顯示，金盞菊提取物對C57BL/6小鼠B16F-10黑色素瘤細胞的轉移有抑制作用。對金盞菊化學成分的研究表明[11]，它富含黃酮類、揮發油、皂苷類、色素類等多種有效成分，同時還含有碳水化合物、脂類、蛋白質、維生素、可溶性糖類等多種營養成分。近年來對金盞菊化學成分的研究多集中在色素、揮發油和黃酮類成分[12-13]，對其皂苷類成分的提取方法研究較少，且對金盞菊活性的研究多集中在金盞菊提取物的活性研究，對金盞菊皂苷類成分的活性研究較少。

微波輔助提取法具有加速細胞破壁、提高提取效率、節約溶劑等優點，且設備簡易、選擇性高，目前廣泛應用于黃酮類、多糖類、色素類等成分的提取[14-15]。超聲波輔助提取技術是利用超聲波的強振動使細胞破壁并充分進入到溶劑中，可以有效地縮短提取時間，提高提取效率，目前已廣泛應用于大多數天然產物的活性成分的提取[16]。

本文采用響應面法對微波超聲協同提取金盞菊皂苷的工藝進行優化，并對其體外抗氧化活性進行初步研究，以期為更好地開發利用金盞菊資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金盞菊：安國市旭芳中藥材經營有限公司；2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：美國Sigma公司；2，4，6-三吡啶基三嗪 [2，4，6-Tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ]：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；齊墩果酸標準品：上海源葉生物科技有限公司；香草醛：北京索萊寶科技有限公司；甲醇、乙醇、冰醋酸、濃硫酸（分析純）：天津鑫橋化工貿易有限公司。

XO-SM100超聲波微波協同反應系統：南京先歐儀器制造有限公司；UV-2802S紫外可見分光光度計：上海尤尼柯公司；RV10旋轉蒸發儀：廣州IKA儀器設備有限公司；Quintix125D分析天平：北京賽多利斯科學儀器有限公司；Integral 10超純水系統：德國Merck公司；DFT-500中藥粉碎機：浙江榮浩工貿有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 金盞菊皂苷提取工藝

準確稱取金盞菊粉末2.00 g，在一定的液料比下加入不同濃度的乙醇溶液，在一定的微波功率下處理2 min，固定提取溫度為50℃，提取一定的時間，抽濾，得到金盞菊皂苷提取液。

1.2.2 單因素試驗

1.2.2.1 液料比對提取率的影響

固定乙醇濃度為60%，微波功率400 W，微波時間2 min，提取溫度50℃，超聲時間10 min，考察液料比為 5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g）對金盞菊皂苷提取率的影響。

1.2.2.2 乙醇濃度對提取率的影響

固定液料比為 20∶1（mL/g），微波功率 400 W，微波時間2 min，提取溫度50℃，超聲時間10 min，考察乙醇濃度為30%、40%、50%、60%和70%對金盞菊皂苷提取率的影響。

1.2.2.3 微波功率對提取率的影響

固定乙醇濃度為 60%，液料比為 20∶1（mL/g），微波時間2 min，提取溫度50℃，超聲時間10 min，考察微波功率為200、300、400、500 W和600 W對金盞菊皂苷提取率的影響。

1.2.2.4 超聲時間對提取率的影響

固定乙醇濃度為 60%，液料比為 20∶1（mL/g），微波功率400 W，微波時間2 min，提取溫度50℃，考察超聲時間為5、10、15、20 min和25 min對金盞菊皂苷提取率的影響。

1.2.3 響應面試驗

在單因素試驗結果的基礎上，根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，利用Design-Expert.V8.0.6.1軟件以皂苷提取率為響應值，選取液料比、乙醇濃度、微波功率、超聲時間為自變量，設計四因素三水平的響應面試驗，對金盞菊皂苷的提取工藝進行優化。響應面的因素水平見表1。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.4 皂苷提取率的測定

準確稱取齊墩果酸標準品10.00 mg，置于100 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，即得濃度為0.1 mg/mL的齊墩果酸儲備液。

準確吸取齊墩果酸儲備液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，于60℃水浴揮干溶劑，分別加入5%的香草醛-冰醋酸0.2 mL和高氯酸0.8 mL，60℃水浴中加熱15 min，取出流水冷卻使其充分反應，分別加入5 mL冰醋酸，搖勻，靜置30 min，在546 nm處測定吸光度，并設空白對照。

以吸光度為縱坐標，齊墩果酸的質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線[17]。回歸方程為y=6.337 9x+0.022 6，R2=0.999 4，線性范圍0.02 mg/mL～0.12 mg/mL。金盞菊皂苷的計算公式（1）如下。

式中：W為皂苷提取率，mg/g；c為根據吸光度計算出的皂苷質量濃度，mg/mL；D為溶液稀釋倍數；V為供試品溶液體積，mL；m為金盞菊取樣量，g。

1.2.5 金盞菊皂苷體外抗氧化作用評價

1.2.5.1 DPPH自由基清除率的測定

參照黃煦杰等[18]的方法，分別取2.0mL濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50 mg/mL 的金盞菊皂苷提取液和VC溶液，加入2.0 mL濃度為0.2 mmol/L的DPPH-乙醇溶液，置于暗處靜置30 min，測定517 nm處的吸光度A，根據公式（2）計算DPPH自由基清除率。

式中：A為樣品溶液的吸光度；A1為樣品溶液本底吸光度；A0為空白對照溶液吸光度。

1.2.5.2 ABTS+自由基清除率的測定

參照楊潔等[19]的方法，取2 mmol/L ABTS溶液50 mL和70 mmol/L過硫酸鉀溶液200 mL混勻后，低溫放置12 h，使用時用無水乙醇稀釋，使其在734 nm波長處吸光度A0為0.70±0.02。分別取0.1 mL濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50 mg/mL 的金盞菊皂苷提取液和VC溶液，加入1.9 mL稀釋后的ABTS+溶液，靜置15 min，測定734 nm處的吸光度A，根據公式（3）計算ABTS+自由基清除率。

式中：A0為稀釋后的ABTS+溶液的吸光度；A為樣品溶液在734 nm處測定的吸光度；A空為用無水乙醇代替樣品在734 nm處測定的吸光度。

1.2.5.3 鐵離子還原能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）的測定

FRAP工作液：配制0.3 mol/L pH3.6的醋酸鈉緩沖液、10 mmol/L的TPTZ溶液和20 mmol/L的三氯化鐵溶液，按10∶1∶1的體積比混合即得FRAP工作液。

參照Xiong等[20]的方法，分別取0.1mL濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50 mg/mL 的金盞菊皂苷提取液和VC溶液，加入3 mL FRAP工作液，充分混合均勻后，在37℃水浴避光反應10min，在593nm測定吸光度。按照上述方法，測定FeSO4系列標準溶液（濃度范圍0.1 mmol/L～1.0 mmol/L）的吸光度，得到標準曲線，根據回歸方程計算出對應的FeSO4濃度，即為FRAP值，此值越大，表明其還原能力越強。

1.3 數據處理

本試驗操作均平行測定3次，取平均值。采用Design-Expert.V8.0.6.1軟件進行響應面試驗設計，SPSS 20.0軟件對數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 液料比對金盞菊皂苷提取率的影響

液料比對金盞菊皂苷提取率的影響見圖1。

圖1 液料比對金盞菊皂苷提取率的影響Fig.1 The effect of material liquid ratio on extraction rate of Calendula officinalis saponins

如圖 1 所示，在液料比為 10∶1（mL/g）～20∶1（mL/g）時，隨著溶劑的增加，金盞菊皂苷提取率呈上升狀態，液料比為 20∶1（mL/g）時，皂苷提取率最高，達到 17.36mg/g，當液料比超過20∶1（mL/g）時，金盞菊皂苷提取率呈下降趨勢。可能是溶劑太少不利于皂苷的溶出，溶劑太多導致非皂苷成分溶出增加，皂苷提取率下降。故選取液料比 15∶1、20∶1、25∶1（mL/g）進行響應面優化試驗。

2.1.2 乙醇濃度對金盞菊皂苷提取率的影響

乙醇濃度對金盞菊皂苷提取率的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對金盞菊皂苷提取率的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on extraction rate of Calendula officinalis saponins

如圖2所示，當乙醇濃度在30%～60%之間時，金盞菊皂苷提取率隨乙醇濃度的升高而增大，當乙醇濃度為60%時，金盞菊皂苷提取率達到最大，為18.22 mg/g，之后隨著乙醇濃度的升高，金盞菊皂苷的提取率反而降低，可能是由于隨著乙醇濃度的增加，溶液的極性發生了變化，一些非皂苷成分的溶出增加，導致了提取率下降。因此選取乙醇濃度50%、60%、70%進行響應面試驗。

2.1.3 微波功率對金盞菊皂苷提取率的影響

微波功率對金盞菊皂苷提取率的影響見圖3。

圖3 微波功率對金盞菊皂苷提取率的影響Fig.3 The effect of microwave power on extraction rate of Calendula officinalis saponins

如圖3所示，隨著微波功率的升高金盞菊皂苷提取率增大，是因為金盞菊中各個成分吸收的能量使分子的無規則熱運動加強導致擴散速率增加，當微波功率為400 W時，金盞菊皂苷提取率為18.46 mg/g，達到最大，之后隨著微波功率升高，金盞菊皂苷的提取率不升反而呈現小幅度下降，可能是因為高強度的微波作用產生過高的溫度，導致了皂苷的降解。因此選取微波功率300、400、500 W進行響應面試驗。

2.1.4 超聲時間對金盞菊皂苷提取率的影響

超聲時間對金盞菊皂苷提取率的影響見圖4。

圖4 超聲時間對金盞菊皂苷提取率的影響Fig.4 The effect of ultrasonic time on extraction rate of Calendula officinalis saponins

由圖4可知，超聲時間在5 min～10 min內，隨著超聲時間的延長，皂苷提取率增加，超聲時間為10 min時其提取率最高，達到18.23 mg/g。之后隨著超聲時間的延長，金盞菊皂苷的提取率變化不大，說明微波超聲協同作用下能夠提高提取率，超聲10 min時皂苷成分基本全部溶出，隨著超聲時間的延長，溶出不再增加。因此選取5、10、15 min進行響應面試驗。

2.2 響應面法優化結果與分析

2.2.1 模型建立及方差分析

利用Design-Expert.V8.0.6.1軟件對所得數據進行響應面分析，響應面設計結果見表2。

表2 響應面試驗設計結果Table 2 Program and results of response surface method

續表2 響應面試驗設計結果Continue table 2 Program and results of response surface method

經回歸擬合后，得出模型的二次多項回歸方程為Y=21.110 4-0.372 5A-0.517 7B+0.221 0C-0.223 2D-0.082 50AB+0.312 0AC-0.431 5AD+0.372 0BC+0.403 5 BD-0.7320CD-0.6753A2-0.6783B2-0.7128C2-1.2273D2。

對上述回歸模型的方差及顯著性分析結果見表3。

表3 模型回歸方差分析結果Table 3 Variance analysis results of regression equation

由表3可知，模型的p<0.000 1，達到極顯著性，失擬項的p值為0.432 5，不顯著，表明該模型的擬合度良好，R2=0.960 7，表明有96.07%的試驗數據可以運用該模型進行分析，試驗誤差小，模型的可靠性較高。因此，可用該模型分析和預測金盞菊皂苷的提取率。

由表3還可看出，模型中一次項A和B，二次項A2、B2、C2和 D2，交互項 AD、BD 和 CD 對金盞菊皂苷提取率影響極顯著（p<0.01）；一次項C和D，交互項AC和BC對金盞菊皂苷提取率影響顯著（p<0.05），根據F值大小可以判斷出各因素對金盞菊皂苷提取率的影響大小依次為B（乙醇濃度）>A（液料比）>D（超聲時間）>C（微波功率）。

2.2.2 因素間交互作用分析

通過Design-Expert.v8.0.6.1軟件繪制的響應面立體曲面圖進一步分析和評價兩個因素之間的交互作用，其曲面越陡峭，說明兩個因素的交互作用越顯著，各因素交互作用響應面圖見圖5。由圖5可以看出，AD、BD和CD的交互作用對金盞菊皂苷提取率的影響極顯著，這與表3的方差分析結果相一致。

圖5 各因素交互作用對金盞菊皂苷提取率的影響Fig.5 Response surface plot and contour plot of the effects of each factor on the extraction rate of Calendula officinalis saponins

2.2.3 驗證試驗

由回歸方程得到的金盞菊皂苷最佳提取工藝條件為液料比 19.08∶1（mL/g），乙醇濃度 56.10%，微波功率408.99 W，超聲時間9.25 min。在此工藝條件下金盞菊皂苷提取率的預測值為21.272 mg/g?？紤]到實際操作的可行性，將上述最佳工藝條件修正為液料比19∶1（mL/g），乙醇濃度 56%，微波功率 410 W，超聲時間9.2 min，進行3次平行試驗，得到金盞菊皂苷提取率平均值為21.298 mg/g，與理論預測值相差2.6%，說明由該模型優化的最佳提取工藝條件穩定可靠，具有實際應用價值。

2.3 金盞菊皂苷體外抗氧化活性測定結果

2.3.1 DPPH自由基清除能力

不同濃度的金盞菊皂苷對DPPH自由基的清除作用見圖6。

圖6 不同濃度的金盞菊皂苷對DPPH自由基的清除作用Fig.6 Scavenging ability of different concentration of Calendula officinalis saponins on DPPH

由圖6可知，金盞菊皂苷和VC溶液對DPPH自由基的清除率隨濃度的增加而逐漸增強，呈現明顯的正相關性。金盞菊皂苷濃度為0.50 mg/mL時，其對DPPH自由基清除率達到61.36%，IC50為0.282 mg/mL，但弱于VC（IC50為0.028 mg/mL），表明金盞菊皂苷對DPPH自由基具有一定的清除能力及抗氧化活性。

2.3.2 ABTS+自由基清除能力

不同濃度的金盞菊皂苷對ABTS+自由基的清除作用見圖7。

圖7 不同濃度的金盞菊皂苷對ABTS+自由基的清除作用Fig 7 Scavenging ability of different concentration of Calendula officinalis saponins on ABTS+

由圖7可知，金盞菊皂苷和VC溶液對ABTS+自由基的清除率隨濃度的增加而逐漸增強。金盞菊皂苷濃度為0.50 mg/mL時，其對ABTS+自由基的清除率達到60.38%，IC50為0.337 mg/mL，但弱于VC（IC50為0.063 mg/mL），表明金盞菊皂苷對ABTS+自由基具有一定清除能力及抗氧化活性。

2.3.3 鐵離子還原能力測定結果

FRAP法測定金盞菊皂苷還原能力如圖8所示。

圖8 不同濃度金盞菊皂苷的鐵離子還原能力Fig 8 Reducing power of different concentration of Calendula officinalis saponins

由圖8可知，FRAP法測定抗氧化活性有劑量依賴關系，在測定的濃度范圍內，隨著濃度的增加，金盞菊皂苷和VC的FRAP值增大，且呈一定的正相關，表明金盞菊皂苷具有一定的還原能力。

3 結論

本試驗采用微波超聲協同提取金盞菊皂苷，通過單因素試驗和響應面優化得到的最佳提取工藝條件為液料比 19∶1（mL/g），乙醇濃度 56%，微波功率 410 W，超聲時間9.2 min。在該條件下，金盞菊皂苷提取率為21.298 mg/g。抗氧化試驗結果表明金盞菊皂苷對ABTS+自由基和DPPH自由基均具有良好的清除能力，且具有良好的還原能力和抗氧化活性。結果表明，微波超聲聯合提取金盞菊皂苷具有顯著的協同作用，能夠明顯地縮短提取時間，提高提取效率。金盞菊資源豐富，具有多種有效成分，基于以上研究，金盞菊皂苷具有良好的清除自由基能力和抗氧化活性，為金盞菊的進一步開發和利用提供一定的理論依據。