響應面優化超聲輔助雙水相提取檳榔多糖及抗氧化活性研究

尹明松，丁賀輝，潘飛兵，匡鳳姣，冀曉龍*，劉延奇*

（1.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南 鄭州 450001；2.海南華創檳榔研究院，海南 海口 571600；3.海南口味王科技發展有限公司，海南 萬寧 571542）

檳榔（Areca catechu L.）為棕櫚科（Palmaceae）檳榔屬（Areca）常綠喬木，其干燥的成熟種子稱為檳榔（Semen Arecae），又名橄欖子、大腹子、青仔、榔玉等，廣泛分布于我國南部熱帶、亞熱帶地區[1-2]。檳榔為我國“四大南藥”之首，在我國中醫藥的應用已超過千年；《本草綱目》中記載，檳榔具有“下水腫、通關節、健脾調中、治心痛積聚”等功效；其味辛、苦，性溫，歸胃、大腸經，具有消積殺蟲、行水降氣等功效，是常用的驅蟲消積的藥物，主治人體腸道寄生蟲、食積腹痛、水腫脹滿等[3]。現代研究表明，檳榔含有多種活性成分，包括生物堿、黃酮、單寧、三萜、甾體、多糖、脂肪酸、氨基酸等多種成分[4]，具有促消化、降血糖、抗抑郁、抗氧化、抗炎、抗寄生蟲、抑菌等活性[5]。

雙水相提取是一種新型的用于提取、分離、純化的技術，具有操作簡單、條件溫和、綠色環保等特點[6]。通過雙水相提取的天然產物可獲得較高的得率和純度，尤其適用于活性要求高、產物濃度高的天然產物的分離。目前，研究采用超聲波技術和微波技術與不同的雙水相體系聯合起來可快速、簡便、高效萃取制備植物多糖，巫永華等[7]利用超聲輔助雙水相（NH4）2SO4-聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）6000提取牛蒡多糖，LIN等[8]利用微波輔助雙水相（NH4）2SO4-乙醇提取香菇多糖，王鑫等[9]采用超聲波輔助異丙醇-硫酸銨雙水相體系分離甜玉米芯多糖，均取得了良好的效果。

目前，有關檳榔活性成分的研究主要集中于生物堿、多酚、單寧等方面，而多糖方面則鮮見報道；僅有唐敏敏等[10]采用響應面組合設計優化超聲波輔助提取未成熟的檳榔籽多糖的工藝研究。超聲波輔助雙水相體系提取技術用于檳榔多糖的研究未見報道，本研究采用響應面優化超聲輔助（NH4）2SO4-乙醇雙水相體系提取檳榔多糖的提取參數，優化檳榔多糖的提取條件，并研究其體外抗氧化活性，以期為海南檳榔產業綠色可持續發展提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

檳榔：湖南口味王集團有限責任公司；DPPH試劑、ABTS試劑：上海麥克林生化試劑有限公司；無水乙醇：成都市科隆化學品有限公司；雙氧水、過硫酸鉀、抗壞血酸：國藥集團化學試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

KQ3200E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；R206旋轉蒸發儀：上海申生科技有限公司；Scientz-12N型真空冷凍干燥機：德國CHRIST公司；TU-1810紫外分光光度計：北京普析通用有限公司；L550離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.2 方法

1.2.1 雙水相體系的確定

本研究采用（NH4）2SO4-乙醇體系提取檳榔多糖，采用濁度滴定法確定雙水相系統圖，硫酸銨逐步加入一定體積的乙醇溶液中，記錄滴加量[11]。制備30%乙醇溶液600 mL備用，準確稱取硫酸銨100 g，按照硫酸銨比乙醇溶液為2∶1（g/mL）加入至30%乙醇中，在電磁攪拌器的作用下，快速溶解硫酸銨20 min，冷卻至25℃，可觀察到明顯的分層現象，上相為乙醇和水，下相為硫酸銨飽和溶液。

1.2.2 檳榔多糖提取率計算

按照苯酚-硫酸顯色法繪制葡萄糖標準曲線[12]，將100 mg/L葡萄糖標準溶液稀釋為不同濃度的待測液，于490 nm處測定溶液的吸光值，繪制以吸光值為縱坐標、葡萄糖濃度為橫坐標的標準曲線，得出的回歸方程為y=8.405 7x+0.004 1，R2=0.992 8，線性關系良好。試驗提取得到的檳榔多糖，加蒸餾水定容至100 mL，吸取1 mL稀釋液，采用苯酚-硫酸法進行測定；利用標準曲線回歸方程計算檳榔多糖含量。

1.2.3 超聲輔助雙水相體系提取檳榔多糖試驗設計

1.2.3.1 單因素試驗設計

1）不同料液比的提取試驗：（NH4）2SO4-乙醇雙水相體系組成質量為2∶1，固定超聲時間30 min，超聲溫度 60 ℃，考察料液比 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）對檳榔多糖提取率的影響。

2）不同超聲時間的提取試驗：固定料液比 1∶30（g/mL），超聲溫度 60℃，考察超聲時間（10、20、30、40、50 min）對檳榔多糖提取率的影響。

3）不同超聲溫度的提取試驗：固定料液比1∶30（g/mL），固定超聲時間 30 min，考察超聲溫度 40、50、60、70、80℃對檳榔多糖提取率的影響。

1.2.3.2 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選擇超聲溫度、超聲時間、料液比為自變量，以多糖提取率為響應值，根據Box-Behnken設計原理，采用響應面分析法進行試驗設計，優化超聲輔助雙水相提取檳榔多糖的工藝，因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗設計Table 1 Independent variables and their levels of response surface design

1.2.4 檳榔多糖體外抗氧化活性試驗

1.2.4.1 DPPH自由基清除試驗

根據Ji等[13]的方法，并稍作修改。用無水乙醇配制0.2 mol/L的DPPH溶液，吸取2 mL不同濃度的檳榔多糖溶液與2 mL DPPH溶液混勻，置于避光處靜置30 min，在517 nm處測吸光值，以VC作為陽性對照。按公式計算DPPH自由基清除率。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（As-Ab）/Ac]×100

式中：As為2 mL樣品液與2 mL DPPH溶液的吸光值；Ab為添加2 mL檳榔多糖樣品與2 mL 50%乙醇的吸光值；Ac為2 mL去離子水和2 mL DPPH溶液的吸光值。

1.2.4.2 ABTS+自由基清除試驗

參照李旭東等[14]的方法，略作修改。配制7.00mol/L的ABTS溶液與2.45 mol/L的過硫酸鉀溶液，將兩者等體積混合后，置于避光處靜置16 h，將其稀釋至732 nm處的吸光值為（0.7±0.02）。吸取400 μL不同濃度的樣品溶液，與3 mL稀釋好的ABTS溶液混勻，置于避光處靜置30 min，在732 nm處測吸光值，以VC作為陽性對照。按式計算ABTS+自由基清除率。

ABTS+自由基清除率/%=[1-（As/A0）]×100

式中：As為樣品組的吸光值；A0為去離子水代替樣品的空白組吸光值。

1.2.4.3 羥基自由基清除試驗

參照Chen等[15]的方法，略作修改。取1 mL不同濃度的檳榔多糖溶液于試管中，向各管中加入2 mL硫酸亞鐵溶液（3 mmol/L）和1.5 mL水楊酸溶液（1.8 mmol/L）。混勻后，加入0.03%雙氧水0.1 mL啟動反應，混勻。37℃水浴30 min，在波長510 nm下測定吸光值。以去離子水代替多糖溶液做空白，不同濃度的VC替代多糖樣品作為陽性對照。按公式計算羥基自由基清除率。

羥基自由基清除率/%=（A0-Aa）/A0×100

式中：A0為去離子水代替樣品的空白組吸光值；Aa為樣品組的吸光值。

1.3 數據處理

所有數據均為3次重復試驗的平均值，并表示為平均值±標準差，單因素試驗數據運用Origin 7.0軟件繪制趨勢曲線圖；響應面試驗采用Design-Expert 8.0.6軟件進行方差分析，并優化出最佳提取工藝。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對檳榔多糖提取率的影響

料液比對檳榔多糖提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對檳榔多糖提取率的影響Fig.1 Effects of material-to-solvent ratio on polysaccharide yield

由圖 1 可知，在料液比為 1∶10（g/mL）時，由于提取溶劑相對較少，溶液黏度較高而不利于植物多糖的擴散，多糖提取率較低；隨著提取溶劑含量的增加，細胞內外多糖濃度出現較大差異，內高外低，檳榔多糖不斷向外擴散，提取率顯著提高。隨著提取溶劑的進一步增大，在超聲作用下多糖的凝聚作用減弱，多糖開始部分降解，提取率出現下降趨勢，提取溶劑過多還會增加后期濃縮和醇沉的能耗與工作量，增加檳榔多糖的提取成本。因此，選擇料液比為1∶30（g/mL）進行響應面優化。

2.1.2 超聲時間對檳榔多糖提取率的影響

超聲時間對檳榔多糖提取率的影響見圖2。

圖2 超聲時間對檳榔多糖得率的影響Fig.2 Effects of ultrasonic power time on polysaccharide yield

由圖2可知，在10 min～30 min之間，檳榔多糖的提取率隨著超聲時間的延長快速升高，30 min之后多糖的提取率逐漸下降。這可能是在剛開始提取時，檳榔多糖沒有充分溶解在提取溶劑中；隨著超聲時間的延長，檳榔與提取溶劑接觸面積逐步變大，且超聲波的空穴效應促進檳榔多糖的快速傳遞，促使提取率快速上升[16]。但提取一定時間后，檳榔多糖基本溶出完全，提取率不再變化，較長時間的超聲處理，使得部分多糖糖苷鍵斷裂和降解，提取率出現一定的下降趨勢[17]。因此，選擇超聲時間為30 min進行響應面優化。

2.1.3 超聲溫度對檳榔多糖提取率的影響

溫度過低時，分子運動速度較慢，植物多糖無法充分溶出；當溫度升高，分子運動速率加快，植物多糖溶解度增加[18]。超聲溫度對檳榔多糖提取率的影響見圖3。

圖3 超聲溫度對檳榔多糖提取率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic temperature on polysaccharide yield

由圖3可知，檳榔多糖的提取率隨著超聲溫度的升高呈現先增加后略降低的趨勢。這是因為隨著超聲溫度的升高，使檳榔多糖溶出的速度加快，提取率顯著提高。但當超聲溫度過高時，檳榔多糖糖苷鍵結構遭到部分破壞，產生降解作用，檳榔多糖提取率出現略下降趨勢[19]。因此，選擇超聲溫度為60℃進行響應面優化。

2.2 檳榔多糖提取工藝條件的優化

2.2.1 模型方程建立與顯著性檢驗

利用Design-Expert軟件對超聲溫度（A）、超聲時間（B）、料液比（C）3個因素對檳榔多糖提取率（Y）為響應值進行試驗設計，得到的響應面試驗設計分析結果如表2所示（實測值為3次平行試驗結果的平均值），利用Design-Expert 8.0.6軟件分析處理試驗數據，可以得到回歸方程為Y=3.79-0.007A+0.12B+0.037C+0.20AB+0.007 5AC-0.32BC+0.26A2+0.019B2+0.074C2。

表2 響應面試驗設計及試驗結果Table 2 Experimental design and results of the response surface methodology

根據回歸模型方程進行方差分析結果見表3。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equations

由表3方差分析可以看出，該回歸模型P=0.038 4<0.05），說明回歸模型具有統計學差異，失擬項P=0.9821>0.05，差異不顯著，因此試驗中未知因素對試驗結果干擾較小，殘差均由隨機誤差所引起。該模型的相關系數R2=0.840 2，表明有84.02%的試驗值可用預測值來代替，說明該模型擬合度好，試驗誤差小，可以用于響應值的預測。根據F值可看出，影響因子的主效應主次順序為超聲時間>超聲溫度>料液比。交互項BC、二次項A2對試驗結果有影響（P<0.05），說明各工藝條件與提取率之間不是簡單的線性關系，而是一種非線性關系。綜上所述，該模型擬合度高，可用該回歸模型來描述各工藝參數與響應值之間的真實關系。

2.2.2 響應面交互作用影響結果

等高線圖、響應面圖可以直觀地反映兩因素之間的交互作用。響應面圖越陡說明兩自變量的交互作用對響應值影響程度越大；相反，越平緩交互作用影響越不顯著。等高線圖越偏離圓形，交互影響越強；反之，越接近圓形，交互影響越弱。通過Box-Behnken試驗得到的多元回歸模型所作的響應曲面圖見圖4。

圖4 各因素交互作用的響應面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots showing the effects of different extraction parameters on the yield

從圖4可知，主次因素順序為超聲時間＞超聲溫度>料液比；且交互項BC作用顯著，這與方差結果一致。

2.2.3 最優條件的確定與回歸模型的驗證

通過試驗分析，確定超聲輔助雙水相提取檳榔多糖的最佳提取工藝為當超聲溫度為69.54℃，超聲時間為 40.54 min，料液比為 1∶19.96（g/mL）時，此條件下檳榔多糖提取率為4.67%。考慮到實際操作的簡便性和可行性，將提取條件調整為超聲溫度70℃，超聲時間為 40 min，料液比為 1∶20（g/mL），此工藝條件下進行超聲輔助雙水相提取檳榔多糖，試驗重復3次取平均值，得率為（4.52±0.25）%。結果與預測值誤差較小，表明優化后的工藝條件準確可靠，具有一定的應用價值。

2.3 體外抗氧化試驗結果與分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力

檳榔多糖的DPPH自由基清除能力見圖5。

圖5 檳榔多糖的DPPH自由基清除能力Fig.5 DPPH free radical scavenging ability of ACPs

由圖5可知，檳榔多糖及VC對DPPH自由基清除能力隨濃度增加而增強，并且呈現一定的劑量效應關系，在濃度為1.0 mg/mL時，檳榔多糖的DPPH自由基清除率達到35.14%，低于1.0 mg/mL VC91.75%的清除率；當檳榔多糖濃度為2.5 mg/mL時，自由基清除率達到50.86%，這高于蔡延渠等[20]提取的桃膠多糖的抗氧化能力。在本試驗測試的濃度范圍內，盡管檳榔多糖的DPPH自由基清除率不如VC強，但仍具有一定的清除能力，可作為天然抗氧化劑應用。

2.3.2 ABTS+自由基清除能力

ABTS+·是一種穩定的有機自由基，通過ABTS原液與過硫酸鉀在室溫（25℃）黑暗中反應12 h～16 h產生，在外來抗氧化劑存在的情況下，ABTS+·將會減少。通過測定反應液在732 nm波長處吸光值的變化，可得到植物多糖對ABTS+·的清除效果[21]。

由圖6可知，在濃度0～2.0 mg/mL范圍內，檳榔多糖和VC隨著溶液濃度的增加，對ABTS+自由基的清除率先增大后趨于穩定，其中當濃度大于2.0 mg/mL檳榔多糖對ABTS+自由基的清除率趨于平緩，基本保持在40%左右。

圖6 檳榔多糖的ABTS+自由基清除能力Fig.6 ABTS+free radical scavenging ability of ACPs

2.3.3 羥基自由基清除能力

·OH是活性最強、毒性最大的自由基，可以與活細胞中分子發生反應造成損害，且反應速度快，被破壞的分子涉及糖類、氨基酸、磷脂、核苷和有機酸等[22]。檳榔多糖的對羥基自由基清除能力見圖7。

圖7 檳榔多糖對羥基自由基清除能力Fig.7·OH free radical scavenging ability of ACPs

由圖7可知，在濃度0～2.0 mg/mL范圍內，檳榔多糖隨著濃度的增加，·OH清除率逐漸增強；檳榔多糖溶液濃度從0.5 mg/mL增加到2.5 mg/mL，·OH的清除率從20.32%增加到46.86%。

3 結論

采用超聲輔助雙水相體系結合響應面優化法建立了檳榔多糖提取率的二次多項式數學模型，在（NH4）2SO4乙醇的質量比為2∶1時，雙水相體系最佳；優化出檳榔多糖提取的最佳工藝條件為料液比1∶20（g/mL），超聲溫度 70℃，超聲時間 40 min，檳榔多糖的提取率達到（4.52±0.25）%。3種體外抗氧化試驗的結果均顯示檳榔多糖具有較好的抗氧化活性，可作為潛在的天然抗氧化劑應用于功能性食品等領域，但檳榔多糖體內抗氧化活性的相關機制有待于進一步研究。