一株分離自嬰兒腸道的乳雙歧桿菌BL-99的菌株鑒定

于學健，劉錦浲，趙婷，馬霞，劉藝茹，劉偉賢，程坤，張欣，曹艷花， 辛迪，馮慧軍，劉福東，趙雯，洪維鍊，姚粟*

1(中國食品發酵工業研究院有限公司,中國工業微生物菌種保藏管理中心，北京，100015) 2(內蒙古乳業技術研究院有限責任公司，內蒙古 呼和浩特，010110) 3(內蒙古伊利實業集團股份有限公司，內蒙古 呼和浩特，010110)

動物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis)和乳雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis)具有維護腸道微生態平衡、提升免疫力等作用，具備良好的安全性和長久的安全使用歷史[1]，已被列入我國《可用于食品菌種名單》[2]和歐盟安全資格認定(qualified presumption of safety, QPS)名單中[3]，研究表明B.animalis等益生菌的功能性和安全性特征在菌株水平具有特異性[4]。隨著分類學技術的發展，B.animalis和B.lactis的分類學地位已變遷為B.animalis的2個亞種，分別為動物雙歧桿菌動物亞種(B.animalissubsp.animalis)和動物雙歧桿菌乳亞種(B.animalissubsp.lactis)，隨著各類食品資源的開發利用，新的動物雙歧桿菌菌株不斷涌現，目前已有多株動物雙歧桿菌商業化菌株在乳制品、嬰幼兒食品、保健食品等領域廣泛應用，在功能性、安全性等方面存在較大差異。動物雙歧桿菌乳亞種菌株BL-99是1株分離自嬰兒腸道的益生菌，該菌株耐胃酸和耐腸液性能良好，具有調節胃腸道菌群、促進腸道消化、提升宿主免疫力等功效，在發酵乳、固體飲料及保健食品等領域具有廣泛的應用潛力[5-8]。

益生菌菌株的精確鑒定是功能開發、安全性評價、產品質控、市場監管等領域的重要基礎，建立體系完善的菌株鑒定技術體系可有效促進行業的健康快速發展。益生菌菌株鑒定通常在菌種鑒定的基礎上開展[9]，菌種分類學地位的確認通?？赏ㄟ^菌落菌體形態、生理生化特征分析、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry， MALDI-TOF MS)等表型鑒定技術結合16S rRNA基因、平均核苷酸一致性(average nucleotide identity, ANI)分析等分子生物學鑒定技術實現[10-13]。隨著微生物分類鑒定技術尤其是分子生物學的發展，菌株鑒定技術方法發展日新月異?；谌蚪M測序(whole genome sequencing, WGS)的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)分析和多位點序列分型(whole-genome multilocus sequence typing, wgMLST)分析技術憑借其全面的遺傳信息和較高的分辨率成為菌株鑒定的可靠方法[14-17]，在市場中的應用和需求日漸增加。但目前，國內外關于WGS技術用于益生菌菌株鑒定的評價方法仍無統一標準。

本研究針對動物雙歧桿菌乳亞種B.animalissubsp.lactisBL-99，通過形態學、生理生化等表型鑒定技術，結合WGS、wgMLST、SNP分析等分子生物學技術，開展動物雙歧桿菌菌株鑒定研究，為建立適用于動物雙歧桿菌乳亞種B.animalissubsp.lactisBL-99的菌株鑒定流程奠定技術基礎。通過菌株鑒定實現益生菌的精準溯源，為產品質量控制提供可靠的技術標準，同時為政府監管、行業標準法規制定提供技術參考，對促進益生菌在食品行業更加安全和廣泛的應用具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株

菌株BL-99，內蒙古伊利實業集團股份有限公司；模式菌株動物雙歧桿菌動物亞種B.animalissubsp.animalisCICC 6250T、動物雙歧桿菌乳亞種B.animalissubsp.lactisCICC 24210T，中國工業微生物菌種保藏管理中心。其他7株商業化參考菌株分離自有明確菌株聲稱的乳飲料、滴劑及菌劑等產品。菌株具體信息見表1。

表1 菌株信息Table 1 Information of selected strains

1.1.2 實驗儀器

ECLIPSE 80i光學顯微鏡，尼康儀器(上海)有限公司；隔水式培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；Hitachi SU8010掃描電鏡，日立高新技術(上海)國際貿易有限公司；BAL-TEC SCD005噴金-離子濺射儀；基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀，德國布魯克公司；BGISEQ-500高通量基因測序儀、BGIDL-50全自動樣本加載系統，深圳華大智造科技有限公司；微量可調移液器、小型臺式冷凍離心機，德國Eppendorf公司；高壓滅菌鍋，日本HIRAYAMA公司；Q800R2超聲打斷儀，美國Sonicator公司；Qubit 3.0核酸熒光定量儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.1.3 實驗試劑

MRS瓊脂、強化梭菌培養基，美國BD公司；API 20 A培養基、API 20 A試驗條，法國生物梅里埃公司；革蘭氏染色液、0.85%生理鹽水，北京陸橋技術股份有限公司；厭氧產氣袋，日本三菱化學公司；溶菌酶、RNase A溶液、GoldView、瓊脂糖，北京全式金生物技術有限公司；通用DNA文庫制備試劑套裝(MGIEasy)、BGISEQ-500RS(PE100)高通量測序試劑套裝，深圳華大智造科技有限公司；Qubit?dsDNA HS Assay Kit、Qubit?ssDNA Assay Kit，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 形態學觀察

采用四區劃線法將菌株BL-99接種于強化梭菌培養基平板，于36 ℃厭氧條件下培養48 h后，觀察菌落形態，并進行革蘭氏染色觀察菌體形態。菌株BL-99經無菌生理鹽水漂洗后用戊二醛固定過夜，將漂洗后的菌體加入到濾紙包中，乙醇梯度脫水，CO2臨界點干燥3次后，將樣品放置到噴金-離子濺射儀中噴金3次，使用掃描電鏡進行菌體形態觀察。

1.2.2 API鑒定

菌株BL-99于強化梭菌培養基上36 ℃厭氧培養24 h，用無菌棉簽挑取足量菌落加入API 20 A培養基中制得混濁度相當于3 McFarland的菌懸液，接種于API 20 A實驗條，36 ℃厭氧培養24～48 h后，加入附加試劑判讀結果。試驗條判讀結果使用數據庫API 20 A V3.0進行鑒定。

1.2.3 MALDI-TOF MS鑒定

采用甲酸萃取法制備檢測樣本，分別挑取培養皿中各實驗菌株菌體，混勻于300 μL超純水中，添加900 μL無水乙醇漩渦振蕩1 min，離心菌體并去除上清液，完全去除乙醇后，用50 μL 體積分數70%的甲醇重懸菌體細胞，再加入50 μL乙腈，通過移液槍反復吹打混合懸液；將制備的懸液按照MALDI-TOF MS檢測規程進行鑒定分析，確定菌種分類學地位。

1.2.4 WGS及分析

1.2.4.1 菌株DNA提取及測序

采用商業化細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，使用MGIEasy通用DNA文庫制備試劑套裝依照其說明書進行建庫，文庫經質控合格后按照BGISEQ-500RS高通量測序試劑套裝(PE100)的操作說明依次完成上機測序。

1.2.4.2 菌株ANI分析

以模式菌株動物雙歧桿菌乳亞種B.animalissubsp.lactisDSM 10140T(GCF_000022965.1)、動物雙歧桿菌動物亞種B.animalissubsp.animalisATCC 25527T(GCA_000260715.1)為參考菌株，利用fastaANI(v 1.3)軟件對測序菌株進行ANI分析。

1.2.4.3 菌株引物比對(Primer BLAST)分析

依托各菌株全基因組信息，以groEL基因特異性引物開展Primer BLAST分析，將得到的groEL序列通過NCBI BLAST比對分析，確定亞種的分類學地位。

1.2.4.4 wgMLST分析

針對所有待分析菌株的蛋白基因集進行CD-HIT(v 4.6.6)聚類分析，提取樣品中共有基因和特有基因集，基于目標菌株和參考菌株的共有基因矩陣構建系統進化樹。用TreeBeST(v 1.9.2)的PHYML(最大似然法)算法構建系統進化樹，Bootstraps參數設置為1 000。

1.2.4.5 SNP分析

利用MUMmer 比對軟件，將每個樣品與參考序列進行全局比對，檢出潛在SNP位點；提取參考序列SNP位點兩邊各100 bp序列，然后用BLAT將提取的序列和組裝結果進行比對，驗證SNP 位點。采用BLAST、TRF、Repeatmask 軟件預測重復序列位點，過濾去除重復區SNP，最后得到可靠的SNP。

2 結果與分析

2.1 形態學觀察

菌株BL-99在強化梭菌培養基上36 ℃厭氧培養48 h，菌落白色、圓形、表面濕潤、不透明、邊緣整齊(圖1-a)；光學顯微鏡下觀察，菌體呈端部膨大的桿狀，(0.5～0.7) μm×(0.8～2.3) μm，單個或成對排列，革蘭氏陽性(圖1-b)。掃描電鏡觀察，菌株BL-99菌體呈端部膨大的桿狀，(0.5～0.6) μm×(1.3～2.5) μm，單個或成對排列(圖1-c)，其菌落和菌體形態符合動物雙歧桿菌典型特征。

a-菌落形態；b-菌體顯微形態；c-菌體掃描電鏡形態圖1 菌株BL-99菌落和菌體形態Fig.1 Colony and morphology of strain BL-99

2.2 API鑒定結果

菌株BL-99的API生理生化結果如表2所示。菌株BL-99經API 20 A系統鑒定為雙歧桿菌屬(Bifidobacteriumsp.)，鑒定百分率為99.7%，T值為1.0。本研究中目標菌株BL-99鑒定至屬水平，與鑒定系統中生理生化反應及數據庫中菌株收集的數量有關，其提供的代謝特征可為后續菌株功能開發提供基礎數據。

表2 菌株BL-99 的API分析結果Table 2 API analysis results of strain BL-99

2.3 菌株BL-99及參考菌株MALDI-TOF MS鑒定

本研究通過MALDI-TOF MS鑒定，確定菌株BL-99和參考菌株的菌種分類學地位。MALDI-TOF MS數據庫中目前包含25種雙歧桿菌圖譜，其中動物雙歧桿菌數據有3株，各試驗菌株與數據庫中標準菌株核糖體蛋白圖譜的鑒定比對值達到2以上，專屬菌株及參考菌株均鑒定為動物雙歧桿菌B.animalis(表3)，鑒定結果具有較高的可信度。MALDI-TOF MS是近年來新興的微生物快速鑒定系統，通過檢測微生物核糖體等高豐度穩定表達的特征蛋白指紋圖譜，與已知微生物菌種蛋白指紋圖譜數據庫比對分析后，進行快速菌種鑒定，該方法已進入國家標準GB/T 33682—2017[10]，在工業微生物(含乳桿菌屬和雙歧桿菌屬)菌種鑒定方面有較好的應用效果[18]。

表3 不同動物雙歧桿菌B.animalis參考菌株的MALDI-TOF MS檢測結果Table 3 MALDI TOF MS results of different B.animalis strains

2.4 ANI分析

對菌株BL-99和參考菌株進行全基因組測序，測序結果顯示試驗菌株全基因組測序數據Q30均在90%以上，滿足后續組裝及分析要求，數據經基因組組裝，動物雙歧桿菌B.animalis菌株基因組大小和GC含量符合該菌種的正常水平，本研究中的所有菌株測序深度達300X以上，滿足后續分析的數據需求。

選取模式菌株B.animalissubsp.lactisDSM 10140T(ref1)和B.animalissubsp.animalisATCC 25527T(ref2)的全基因組序列作為參考序列進行ANI分析，結果表明不同動物雙歧桿菌B.animalis與參考模式菌株全基因組序列的ANI值均達到95%以上(表4)，其中菌株BL-99-1為目標菌株的原始菌株，菌株BL-99-2為同一菌株傳代培養5代的菌株。ANI于2007年由GORIS等[12]提出，指2個基因組序列之間的整體相似性，作者通過比較大量模式菌株的兩兩基因組指出，ANI值95%～96%可作為細菌菌種鑒定的有效判定指標。本研究選取不同培養代數菌株BL-99(BL-99-1/2)及相關參考菌株均鑒定為B.animalis。

通過對各菌株的Primer BLAST分析，得到了目標菌株及參考菌株的groEL基因序列，經過NCBI比對分析及系統發育分析表明，菌株BL-99及7株參考菌株均為動物雙歧桿菌乳亞種(B.animalissubsp.lactis)。

表4 不同動物雙歧桿菌B.animalis的ANI分析結果Table 4 ANI analysis results of different B.animalis strains

2.5 wgMLST分析

經過序列比對分析得到各菌株的核心基因共有1 562個(圖2)，以共有基因為基礎，開展wgMLST分析(圖3)。系統發育分析結果表明，菌株BL-99的兩個序列處于同一分支，系統發育中Bootstrap值達99%以上，具備更近的親緣關系，該方法可有效區分菌株BL-99與本研究中的其他參考菌株。多位點序列分析的分型(multilocus sequence typing, MLST)方法，通過串聯多個基因內部片段序列，對菌株的等位基因進行多樣性的比較，通過不同的序列型分析菌株間的關系，在流行病學監測和進化研究方面有較廣泛的應用[19]。傳統的MLST方法依托PCR擴增少數持家基因進行序列分析，由于選擇的基因數量較少，可能不能得到較好的菌株區分效果[20]?；赪GS的wgMLST方法主要通過對菌株間的所有共有基因進行差異分析和系統發育分析來實現菌株分型。DURANTI等[16]對18株青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)進行全基因測序和wgMLST分析，結果表明通過對872個共有基因的進行差異分析和系統發育分析，不同株青春雙歧桿菌(B.adolescentis)可得到良好區分。

圖2 實驗菌株序列的共有基因分布Fig.2 Distribution of common genes in experimental strains

圖3 基于wgMLST的動物雙歧桿菌B.animalis系統發育分析Fig.3 Phylogenetic analysis of B.animalis strains based on wgMLST

本研究中通過全基因組序列數據分析，選取目標菌株和參考菌株的所有1 562個共有基因進行系統發育分析，可將目標菌株BL-99與參考菌株進行有效區分；通過對B.animalisBL-99基因組的系統分析，深入挖掘該菌株與參考菌株共有及特有基因差異，優選適合的基因組合，可為建立更快捷的基于PCR MLST的B.animalisBL-99菌株鑒定技術提供技術支撐。

2.6 SNP分析

以B.animalissubsp.lactisBL-99的基因組序列為參考，SNP分析結果如表5所示。經過5代傳代培養的B.animalissubsp.lactisBL-99基因序列與參考序列相比，其SNP差異分別為0，其余菌株與參考基因組的SNP差異均大于32，結果表明B.animalissubsp.lactisBL-99可與9株其他菌株良好區分。基于SNP差異的系統發育分析也顯示2株B.animalissubsp.lactisBL-99的基因序列聚集在同一分支，可與其他菌株進行明顯區分(圖4，單核苷酸位點變化由不同顏色表示)。通過對大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、單增李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)等致病菌的SNP分析研究表明，21個SNP差異是判斷同一菌株的標準之一[21]，SNP分析在益生菌領域的研究主要包括乳桿菌、雙歧桿菌等不同菌株的分型分析，但目前缺少益生菌菌株鑒定的評判標準，該判定標準與目標菌株及參考菌株的種類與數量密切相關，同時需要菌株來源信息等溯源數據，基于本研究的菌株數量及數據結果分析，SNP分析可實現B.animalissubsp.lactisBL-99的菌株鑒定。

表5 動物雙歧桿菌B.animalis 的SNP分析結果Table 5 SNP analysis results of different B.animalis strains

圖4 菌株BL-99與參考菌株全基因組測序-單核苷酸多態性分析及系統發育樹Fig.4 Phylogenetic analysis of B.animalis strains based on wgSNP

3 結論

本研究建立了一套適用于動物雙歧桿菌乳亞種B.animalissubsp.lactisBL-99的菌株鑒定流程。通過形態學、生理生化(API)、MALDI-TOF MS鑒定、WGS、ANI及groEL基因分析等方法可實現動物雙歧桿菌乳亞種B.animalissubsp.lactisBL-99的亞種鑒定；進一步通過wgSNP和wgMLST可有效區分動物雙歧桿菌BL-99與本研究中的其他9株參考菌株。本研究構建的動物雙歧桿菌乳亞種B.animalissubsp.lactisBL-99菌株鑒定技術流程，為益生菌菌株精確鑒定技術體系的構建提供了有效數據支撐和實踐參考。wgSNP和wgMLST作為分辨率較高的益生菌菌株鑒定技術，其適用范圍、判定標準與研究涵蓋的目標菌株、參考菌株數量密切相關。隨著試驗菌株樣本量的不斷擴充，建立的益生菌菌株鑒定流程和評價標準將更具代表性、覆蓋度和統計學意義。