不同接種方式對青梅酒品質的影響及微生物多樣性研究

劉英杰，黃鈞，劉建，吳重德，金垚，周榮清

(四川大學 輕工科學與工程學院，四川 成都，610065)

青梅(Prunusmume)，又稱果梅，是藥食同源的水果，含有多種有益的活性組分[1]。青梅酒，具有獨特的水果和花香，且有益健康[2]，是一種非常受歡迎的酒精飲料,主要有發酵型和浸泡型，前者在保留了青梅果香的同時，還貢獻了更豐富的營養物質。TIAN等[3]報道，發酵型青梅酒中的氨基酸含量普遍高于浸泡型青梅酒，佐以蔗糖和糯米的發酵型青梅酒，抗氧化性能更好[4]。以不同種屬的酵母菌共培養發酵葡萄酒等果酒，是改善其特征風味的有效途徑[5-7]。目前，研究人員對青梅酒這類小眾果酒的微生物多樣性尚缺乏研究，主要是借鑒葡萄酒釀造的相關技術[8]。原料自身攜帶的微生物是發酵劑的主要來源，青梅果實酸度較高，對微生物群落及代謝影響顯著。基于葡萄酒酵母發酵青梅酒不僅乙醇含量低，揮發性酸含量高，且揮發性組分特色不突出。應用葡萄酒共培養發酵的非釀酒酵母，如Torulasporadelbrueckii，發酵果酒，產揮發酸少且對SO2抗性高，其代謝產物中的異戊醇、苯乙醇、乙酯類和萜烯類可賦予果酒獨特風味[9-10]。其是否適合青梅發酵尚待探討，且與Saccharomycescerevisiae共培對青梅酒發酵的微生物群落及代謝組分的影響尚未見報道。

本文主要研究基于S.cerevisiae單培接種與T.delbruecki順序共培養接種及多輪補料發酵對青梅酒主要理化參數、代謝組分及微生物群落多樣性的影響規律，解析優勢微生物種屬與主要代謝組分的相關性。旨在揭示釀酒酵母與非釀酒酵母共培養對青梅酒特征風味的貢獻規律，奠定過程參數優化的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青梅，四川省大邑縣；一級蔗糖，本地副食商店。草酸、檸檬酸、酒石酸、L-蘋果酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、辛酸甲酯等標準品，Sigma-Aldrich公司(上海)；其他化學藥品，蔚藍化學(中國成都)。

1.2 儀器與設備

Trace 1300-TSQ 9000氣相色譜-三重四級桿質譜聯用儀，配備VF-WAX-MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，美國Thermo Fisher Electron公司；HPLC配備UV/Vis檢測器和有機酸柱(Alltech OA-1000，300 mm×6.5 mm×9 μm)，美國Agilent公司；TU-1901紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；CX31顯微鏡，日本奧林巴斯有限公司。

1.3 實驗步驟

原料經挑選、清洗瀝水，以m(果)∶m(糖)=5∶1逐層用蔗糖覆蓋青梅果(4個50 L發酵罐)，糖漬約36 h后，蔗糖溶解，分別加入偏重亞硫酸鈉至糖梅汁中SO2的質量濃度為120 mg/L，隨后調節(NH4)2HPO4質量濃度為150 mg/L。接種S.cerevisiae(5×106CFU/mL)到發酵罐中，樣品編號為S；接種S.cerevisiae后又接種T.delbrueckiiY7(CCTCC M2019523)的樣品編號為S+T，其初始濃度均為5×106CFU/mL；未接種發酵罐(ZR)為對照。這3個發酵罐同時進行周期性攪拌，另取1個未接種的發酵罐采用靜置發酵方式，以更好地模擬自然發酵，編號為ZD。接種發酵的2個發酵罐，發酵至糖的質量濃度降至0.4 g/L以下，取出清汁(第1輪原酒)后，補加與殘留青梅果等體積的23°Brix的蔗糖溶液，同樣條件發酵結束后，再重復補加蔗糖溶液發酵。第2、3輪接種發酵的原酒標注2F和3F。

1.4 實驗方法

1.4.1 理化指標的測定

主要理化指標(殘糖、總酸、酒精度、揮發酸)的測定參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.4.2 色度和色調的測定

根據BIMPILAS等[11]的方法測定青梅酒的色度和色調，用紫外可見分光光度計測定吸光度，其中色度=A420+A520+A620，色調=A420/A520。

1.4.3 抗氧化活性的測定

抗壞血酸含量采用2,6-二氯酚靛酚滴定法[12]測定。多酚含量、DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除活性采用WANG等[13]的方法測定。總抗氧化能力參照總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)試劑盒說明書(南京建成生物工程研究所)進行分析。

1.4.4 有機酸的測定

HPLC檢測程序：按參考文獻[14]所述方法，稍作修改。采用Agilent Chemstation軟件對色譜數據進行采集和分析，根據檸檬酸、L-蘋果酸、琥珀酸、乳酸和乙酸標準品的保留時間來判定樣品中的有機酸種類，采用外標法定量，應用HPLC分析建立標準曲線，計算上述有機酸含量。

操作方法：準確吸取10.00 mL樣品，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取3 mL上清液加載至經甲醇活化的固相萃取(solid phase extraction，SPE)小柱(成都SWELL公司)洗脫，取中間1 mL洗脫液，再用0.22 μm水系濾膜過濾后待HPLC檢測。HPLC檢測條件：流動相為9.00 mmol/L的H2SO4溶液，恒定流速為0.60 mL/min，柱溫箱溫度為75 ℃，檢測波長為215 nm。

1.4.5 揮發性成分的測定

參考ZHENG等[15]所述方法，稍作修改。準確吸取0.5 mL樣品置于15 mL頂空瓶中，加入2 mL純水，再加入10 μL內標(79 mg/L辛酸甲酯)和1.5 g NaCl后密封，放入60 ℃水浴中預熱平衡15 min，然后插入固相微萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDM，美國Supelco公司)萃取吸附40 min，取出插入GC-MS進樣口解吸5 min后檢測。檢測條件與NIU等[16]所述相同，稍作修改。操作條件：進樣口溫度為270 ℃，升溫程序：40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至100 ℃，然后6 ℃/min升至230 ℃，保持10 min。載氣為高純氦，流速為1 mL/min，不分流模式。質譜離子源傳輸管的溫度分別是300 ℃和250 ℃；電離方式為EI，電子能量70 eV，質量掃描范圍35～400 amu。

1.4.6 高通量測序

DNA提取、PCR擴增按照HE等[17]和TANG等[18]所述的方法進行，并稍作修改。按照Fast DNA SPIN提取試劑盒操作說明對第1輪原酒的微生物進行基因組DNA提取，將提取的DNA進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行分子大小判斷，取3 μL核酸用紫外分光光度計對DNA進行定量。細菌16S rRNA基因的V3-V4區采用通用引物338F/806R，真菌rRNA基因的ITS1區分別用通用引物ITS5F/ITS1R進行擴增。PCR純化產物送至上海派森諾生物科技有限公司，使用MiSeq基因測序試劑盒v3進行2×300 bp雙端測序。

1.5 數據處理

序列數據分析主要使用QIIME(v1.8.0)和R包(v3.2.0)進行。原始數據采用IBM SPSS Statistics 26.0進行單因素方差分析，以確定樣本間的差異，P<0.05表示有統計學意義的顯著性差異。采用SIMCA 14.1(瑞典Umetrics公司)軟件進行偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)。應用Canoco 5.0進行冗余分析(redundancy analysis，RDA)。其他統計分析使用Origin 2018。所有試驗重復3次，數據以平均值±相對標準偏差表示。

2 結果與討論

2.1 主要理化性質及抗氧化活性的差異

如表1所示，主要理化性質、色度和色調等指標隨接種方式的不同而變化。與自然發酵相比，其余原酒，無論是單培接種還是順序共培接種，其殘糖含量均較低，酒精度較高。由于酸脅迫對酵母菌的抑制，導致第1輪的S和S+T的酒精度比后兩輪低[19]。同時，原酒間的總酸和揮發酸含量具有顯著差異，且單培接種的揮發酸低于順序共培接種的。后兩輪總酸和揮發酸以及色度逐輪下降，而色調先上升后下降。在發酵周期方面，ZR和ZD需要1個月左右，而接種強化發酵每輪僅需7～11 d，在充分利用青梅剩余價值的同時，發酵時間明顯縮短。

表1 理化指標及抗氧化活性的差異Table 1 Difference of physicochemical indexes and antioxidant activities

所有原酒的總抗氧化力較高，ABTS清除率和多酚含量沒有明顯差異，DPPH自由基的清除能力高于ABTS的清除能力。然而，抗壞血酸含量相對較低，致使避免芳香化合物氧化能力減弱[20]。

2.2 有機酸的比較分析

如表2所示，樣品間有機酸總含量在9.53～58.76 g/L，從而導致總酸顯著不同。顯然，檢出的5種有機酸中檸檬酸是優勢有機酸，所占比例在78.36%～89.58%，主要是源于青梅，且含量高于浸泡型青梅酒[3]。除第3輪原酒外，含量次之的是蘋果酸，且其含量在樣品間存在顯著差異，它有助于酒中芳香化合物的釋放，提高果酒的鮮味[3]。第3輪，因蔗糖經酵母發酵，琥珀酸成為主要代謝產物之一[21]。此外，后兩輪樣品中檢出了少量乳酸，可能是蘋果酸-乳酸發酵[22]所致。除ZD外，乙酸含量與揮發酸含量呈正相關，且3輪的單培接種都高于共培接種。

表2 有機酸含量的差異 單位：g/L

2.3 揮發性組分的差異

原酒樣品中共檢出了69種揮發性成分(>0.1%)，包括酯(29)、醇(14)、酸(10)、醛(4)、酚(4)和萜(8)等6類，所有樣品都檢出的成分有31種，部分揮發性成分含量差異如圖1-a所示。

S和S+T的3輪發酵的原酒中第2輪揮發性成分的含量最高，對照樣品ZR最低。ZD的總揮發物高于S和S+T的第1輪原酒的，且顯著高于ZR的。ZD與ZR的酯類的比例相似，前者的酸類的比例較后者高，萜烯類比例則低。如圖1-b所示，酵母強化顯著提高了醇類組分的比例，單培接種的酸類組分比例隨發酵輪次減少而共培接種的則先減少后增加，酯類的比例是略減，S+T第2輪的萜烯類組分的比例略增。

醇和酯是優勢組分，前者主要是苯乙醇和異戊醇，與曾報道的結果[23-24]是一致的，酸類次之。酯類組分中，主要是辛酸、癸酸、琥珀酸、乙酸和苯甲酸等5種酸的乙酯衍生物，這些組分賦予青梅酒果香和花香。S和S+T的原酒中，檢出了賦予樣品甜味、柑橘味、花香的癸醛。浸泡型青梅酒中檢出的賦予杏仁香氣的特征組分苯甲醛[25]，本研究在除S外的樣品中也都檢出，HAN等[4]也有類似的報道，可能是源于青梅(核)[26]。4-乙基苯酚、4-乙基愈創木酚、乙基酚等對葡萄酒特征風味貢獻顯著[27]，S.cerevisiae抑制了Brettanomyces/Dekkera生長與代謝所致[28]，所有強化的樣酒中都未檢出。萜烯類含量盡管較低，但閾值小，所以其含量變化顯著影響果酒花香和果香等特征風味。

圖1 揮發性成分含量(a)及相對含量(b)的差異Fig.1 Difference of volatile compounds content (a) and relative content (b)

主要香氣化合物的氣味活度值(odour activity value,OAV)如表3所示。主要香氣化合物、有機酸和理化指標的PLS-DA的結果如圖2所示。這些原酒彼此距離較遠，其72.50%的總方差可被解釋。類似HU等[29]報道的結果，酵母接種方式顯著影響原酒的代謝組成。在這些香氣化合物中，有14種物質的變量投影重要性(variable importance in the projection，VIP)>1，如β-紫羅蘭酮、異戊醇、苯乙醇等，這些物質對PLS-DA模型的方差貢獻較大[30]，且殘糖和酒精度的VIP>1。模型的RX2、RY2和Q2的值(0.91、0.979和0.905)表明，PLS-DA模型較準確地揭示發酵所致青梅酒品質的差異。

圖2 青梅原酒的PLS-DAFig.2 PLS-DA of greengage wines

表3 主要香氣化合物氣味活度值Table 3 Odour activity values of major aroma compounds

2.4 不同青梅酒風味輪廓的差異

以揮發性成分濃度除以相應閾值的OAVs評估其對風味的貢獻，通常OAV>1的貢獻度顯著[31]。OAV>1的共有9種成分，包括γ-癸內酯、癸醛、β-紫羅蘭酮、苯甲酸甲酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、肉桂酸乙酯和己酸乙酯，構建其風味輪廓如圖3所示。這些成分除丁酸乙酯和癸醛外，在所有原酒中都有檢出。肉桂酸乙酯閾值非常低，因而OAV在各樣品中最高，賦予了原酒梅果香、肉桂香和花香，且自然發酵的梅果香更濃。強化發酵的原酒因接種方式及輪次不同導致OAV不同，其特征風味有差異，主要是花香、蜜香、菠蘿果香、脂肪味和果香的芳香強度不同。

2.5 微生物多樣性分析

接種方式對主要發酵過程微生物α-多樣性的影響結果如表4所示。強化發酵提高了細菌豐富度和多樣性。但在S+T的后期，真菌豐富度小于自然發酵樣品，S+T和S在中期，真菌多樣性顯著低于自然發酵樣品。S在后期真菌多樣性顯著高于S+T，但仍低于ZR。

圖3 青梅原酒的風味輪廓圖Fig.3 Flavor profile of greengage wines

表4 不同樣品α-多樣性差異Table 4 Difference of α-diversity in different samples

自然發酵及強化的中、后期的群落組成的差異如圖4所示。強化方式顯著影響真菌群落結構，尤其在發酵中期，這是研究微生物組成及代謝組分關系的關鍵時期[32]。S.cerevisiae強化后，在發酵中期成為優勢菌，在S和S+T中的豐度>91.50%，Pichia的豐度顯著降低(圖4-b)。自然發酵的ZR和ZD則在發酵后期才檢出S.cerevisiae。這些結果證實了接種酵母菌的主要作用之一是縮短發酵時間。KONG等[33]報道了在葡萄酒發酵中Saccharomyces和Pichia具有良好的互作關系，在青梅酒的發酵中后期情況亦是如此。然而Saccharomyces和Torulaspora系偏生關系，S+T的Torulaspora的豐度<0.01%。在ZR和ZD后期發酵醪中檢出Dekkera的豐度較高，這也是揮發性乙基酚的產生原因[28]。對于細菌屬，在S、S+T和ZR中Sphingomonas是優勢菌，可能與發酵過程常攪拌、溶氧較高有關，所以其細菌菌群組成非常類似(圖4-a)。而ZD中Gluconobacter和Acetobacter是優勢菌，直到發酵后期才與ZR的細菌群落趨于相同。

a-細菌；b-真菌圖4 屬水平上細菌和真菌的微生物組成Fig.4 Microbial compositions of bacteria and fungi at genus level

進一步對1輪原酒中后期微生物群落進行了主坐標分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)分析和層次聚類分析(hierarchical cluster analysis，HCA)，結果如圖5所示。細菌方面，S+T和S同對照樣品ZR在發酵中期因細菌群落相似(圖5-a)而聚為一簇(圖5-c)，ZD則單獨聚為一簇；發酵后期，接種強化的樣品細菌群落組成與發酵中期相比略有差異，ZR和ZD細菌群落組成趨于一致但因變化較大而遠離接種強化的樣品。真菌方面，S+T和S發酵前期因真菌群落組成重疊性較大(圖5-b)而聚為一簇(圖5-d)，且遠離ZR和ZD；而在發酵后期，與細菌不同，接種強化的樣品因菌株不同和順序接種而逐漸遠離。

a-一輪細菌PCoA；b-一輪真菌PCoA；c-一輪細菌HCA；d-一輪真菌HCA圖5 屬水平上細菌和真菌的主坐標分析和層次聚類分析Fig.5 PCoA and HCA of bacteria and fungi at genus level

第1輪原酒的主要揮發性成分與微生物組成的RDA結果如圖6所示。

a-發酵中期；b-發酵后期圖6 微生物與香氣化合物的相關性分析Fig.6 Correlation analysis between microbes and aroma compounds

在發酵中期(圖6-a)，接種的S.cerevisiae的豐度與己酸乙酯、苯甲酸甲酯、乙酸異戊酯、異戊醇、橙花叔醇、法尼醇、癸醛等的含量呈顯著正相關，T.delbrueckii的豐度與這些組分也呈正相關，但由于Saccharomyces和Torulaspora系偏生關系而相關性較弱。Pichia的豐度與肉桂酸、棕櫚酸、乙酸、乳酸等4種酸的乙酯及γ-癸內酯等的含量呈正相關，對這些香氣成分貢獻度較大。而在發酵后期(圖6-b)，Dekkera的豐度與4-乙基愈創木酚的含量呈正相關，且在發酵中期與接種酵母呈強烈競爭關系的Pichia在發酵后期則與Saccharomyces表現出良好的協同關系。

3 結論

3種接種方式對青梅酒的理化特性和代謝組分的影響規律的研究結果表明，強化發酵提高了酒精度及自由基清除能力，降低了總酸和揮發酸的含量，且第2輪的糖酸平衡較好。青梅因酸度高，首輪發酵抑制了酵母菌，其乙醇濃度略低于后兩輪的。菌株不同及順序接種影響乙醇、代謝組分的含量，接種強化提高了醇類組分的比例，減少了酸類組分的比例，單培的后兩輪乙醇含量更高而共培的第2輪的萜烯類比例略增。強化導致4-乙基苯酚、4-乙基愈創木酚和乙基酚等特征組分含量顯著降低，突出了萜烯類組分對風味組分的貢獻度，花香和果香更濃郁。對1輪原酒微生物多樣性研究結果表明，強化顯著改變青梅酒的微生物群落結構。S.cerevisiae和T.delbrueckii的貢獻類似，主要是提高了己酸乙酯、苯甲酸甲酯、乙酸異戊酯、異戊醇、橙花叔醇、法尼醇、癸醛等的含量。研究結果為解決原料酸度高影響產品品質，及基于釀酒酵母和非釀酒酵母共培養的發酵果酒過程參數優化奠定了理論基礎。