miR-122 在糖尿病腎病小鼠腎組織中表達變化及作用機制

樊東哲,張曉斌,牟淑敏

(1.山東中醫藥大學第二附屬醫院腎病診療中心,濟南 250000;2.山東中醫藥大學附屬醫院內分泌科,濟南 250000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常見的并發癥之一,是世界范圍內導致終末期腎疾病的主要原因,其發病率逐年上升,嚴重危害人類的健康[1]。 在中國,DN 已經成為我國公共衛生的主要問題之一,給個人、家庭和社會帶來了巨大的負擔。 腎小球肥大增生、基底膜增厚、細胞外基質增多是DN 的病理特征,隨著DN 的進展,逐漸發展為腎小球硬化、間質纖維化,導致腎功能的喪失。 DN 的發生發展機制復雜,目前尚未完全闡明,并且目前尚無有效的治療方法。

目前隨著研究的深入,微小RNA(miRNAs)被發現對包括糖尿病腎病在內的多種疾病的發生發展均有著重要的調控作用[2-3]。 miR-122 定位于人染色體18q21.31 上,在肝中高表達,與精子發生、肝細胞發育、脂質代謝、膽固醇合成以及惡性腫瘤的發生關系密切[4]。 近期研究發現 DN 患者血清miR-122 水平明顯升高,并且血清miR-122 水平與蛋白尿、腎小球濾過率顯著相關,提示miR-122 可能參與了DN 的發生進展,但具體作用機制尚不明確[5]。 因此,本研究中,我們通過建立 DN 小鼠模型,觀察miR-122 在DN 小鼠腎組織的表達變化,并進一步觀察沉默miR-122 對DN 小鼠腎組織的影響及可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康雄性SPF 級C57BL/6 小鼠50 只,鼠齡8~9 周,體重(24.5±1.6)g,購自山東斯科貝斯生物科技公司[SCXK(魯)2016-0001],在山東中醫藥大學附屬醫院實驗動物中心屏障環境[SYXK(魯)2018-0015]常規飼養。 本研究經本院倫理委員會批準(IACUC2019081501),所有操作均符合動物實驗學“3R”原則。

1.2 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素(STZ)(美國 Sigma 公司,批號:S0130);TRIzol 試劑(美國 Invitrogen 公司,批號:15596018);反轉錄試劑盒、qRT-PCR 試劑盒(北京全式金生物公司,批號:AH341-01、AQ321-01);過碘酸雪夫(PAS)染色試劑盒(北京索萊寶公司,批號:G1280);antagomir-122、antagomir-NC(上海吉瑪制藥公司);谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物公司,批號:A005-1-1、A003-1-2、A001-3-1);一抗 Sirt1、fibronectin、GAPDH 抗體(英國 Abcam 公司,批號:ab189494、ab268021、ab8245);一抗α-SMA、HPR 標記的二抗 (武漢博士德公司,批號:BM0002、BA1050)。

1.3 實驗方法

1.3.1 DN 模型制備及動物分組

50 只C57BL/6 小鼠適應性喂養1 周后,隨機選取40 只小鼠采用STZ 腹腔注射聯合高糖高脂飲食建立DN 小鼠模型,剩余10 只小鼠作為正常對照組。 建立DN 模型的小鼠首先給予高脂高糖飼料喂養8 周,給予STZ(30 mg/kg)單次腹腔注射一次后,繼續給予高脂高糖飼料喂養4 周后,選取空腹血糖(FPG)≥16.7 mmol/L,24 h 尿蛋白定量≥20 mg 的小鼠作為DN 模型小鼠[6-7],最終成功造模30 只。正常對照組給予正常飼料常規喂養,給予腹腔單次注射等量的檸檬酸緩沖液。 將30 只DN 小鼠隨機分成分為模型組、antagomir-NC 組、antagomir-122組,每組 10 只。 antagomir-122 組和 antagomir-NC 組造模后,每7 d 分別給予尾靜脈注射antagomir-122(30 mg/kg)和antagomir-NC(30 mg/kg)進行干預,模型組和正常對照組給予尾靜脈注射等量生理鹽水代替。 干預8 周后,取得小鼠血、24 h 尿液后處死小鼠,獲取腎標本。

1.3.2 腎功能檢測

取小鼠血,3000 r/min 離心15 min 取得上層血清,使用全自動生化分析儀檢測小鼠血清尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)水平;取小鼠24 h 尿液,全自動生化分析儀檢測小鼠24 h 尿蛋白定量。

1.3.3 組織病理學分析

小鼠處死后,取出左腎,應用10%中性甲醛固定,經石蠟包埋后,連續切4 μm 切片,應用PAS 試劑盒進行染色,光學顯微鏡下觀察腎組織病理學改變,每張切片隨機選取5 個不同視野,參考文獻的方法進行腎小球硬化評分[8]。

1.3.4 qRT-PCR 檢測腎組織中 miR-122 的表達水平

取小鼠部分右腎皮質組織,TRIzol 試劑提腎皮質組織總RNA,鑒定總RNA 濃度和純度后,應用反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA。 按照qRT-PCR 試劑盒說明書配置擴增反應體系,miR-122 引物序列,正向:5’-GGGTGGAGTGTGACAATGG-3’,反向:5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3’,以 U6 作為內參照,引物序列, 正 向: 5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAA AT-3’,反向:5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。 反應條件:95℃ 30 s,60℃ 20 s,72℃ 20 s,共40 個循環。 miR-122 表達水平用 2-△△Ct法表示。

1.3.5 Western blot 檢測腎組織 Sirt1、α-SMA、fibronectin 蛋白的表達水平

小鼠處死后,取部分右腎皮質組織,RIPA 裂解液裂解組織,提取組織總蛋白,Bradford 法測得總蛋白濃度,取得 30 μg 蛋白樣本,行 10% SDS-PAGE 凝膠電泳,轉至PVDF 膜,室內封膜1 h,分別加入一抗Sirt1(稀釋度 1 ∶1000)、α-SMA(稀釋度 1 ∶2000)、fibronectin(稀釋度 1 ∶1000)和 GAPDH(稀釋度 1 ∶5000)抗體,4℃孵育過夜,加入二抗后,37℃孵育1 h,曝光,顯影,最后使用Image-J 軟件分析各組蛋白的條帶灰度值。

1.3.6 氧化應激水平檢測

小鼠處死后,取部分右腎皮質組織,裂解勻漿后測定蛋白濃度,分別應用 GSH-Px、MDA、SOD 試劑盒參照說明書操作,檢測各組小鼠腎組織GSHPx、MDA、SOD 的水平。

1.4 統計學方法

SPSS 20.0 進行統計分析,計量數據以平均數±標準差()表示,組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠腎功能的比較

與正常對照組比較,模型組小鼠血清Cr、BUN水平及24 h 尿蛋白定量水平均明顯增高(P<0.05);模型組與antagomir-NC 組比較,各項指標差異無統計學意義(P>0.05);與antagomir-NC 組比較,antagomir-122 組小鼠血清 Cr、BUN 水平及 24 h尿蛋白定量水平均明顯降低(P<0.05)。 見圖1。

圖1 各組小鼠腎功能的比較Note. A, Normal control group. B, Model group. C, Antagomir-NC group. D, Antagomir-122 group.Figure 1 Comparison of renal function in each group

2.2 各組小鼠腎小球硬化的比較

與正常對照組比較,模型組小鼠腎小球硬化評分明顯增高(P<0.05);模型組與antagomir-NC 組比較,差異無統計學意義(P>0.05);與antagomir-NC組比較,antagomir-122 組小鼠腎小球硬化評分明顯降低(P<0.05)。 見圖 2。

圖2 各組小鼠腎小球硬化的比較Note. A, Normal control group. B, Model group. C, Antagomir-NC group. D, Antagomir-122 group.Figure 2 Comparison of glomerulosclerosis in each group

2.3 各組小鼠腎組織miR-122 和Sirt1 蛋白表達的比較

與正常對照組比較,模型組小鼠腎組織miR-122 的表達水平明顯增高(P<0.05),而Sirt1 蛋白的表達水平明顯降低(P<0.05);模型組與antagomir-NC 組比較,各項指標差異無統計學意義(P>0.05);與antagomir-NC 組比較,antagomir-122 組小鼠腎組織miR-122 的表達水平明顯降低(P<0.05),而Sirt1蛋白的表達水平明顯升高(P<0.05)。 見圖3。

圖3 各組小鼠腎組織miR-122 和Sirt1 蛋白表達的比較Note. A, Normal control group. B, Model group. C, Antagomir-NC group. D, Antagomir-122 group.Figure 3 Comparison of miR-122 and Sirt1 protein expression in renal tissue of mice in each group

2.4 各組小鼠腎組織氧化應激水平的比較

與正常對照組比較,模型組小鼠腎組織MDA水平明顯增高(P<0.05),而GSH-Px 和SOD 水平明顯降低(P<0.05);模型組與antagomir-NC 比較,各項指標差異無統計學意義(P>0.05);與antagomir-NC 組比較,antagomir-122 組小鼠腎組織MDA 水平明顯降低(P<0.05),而GSH-Px 和SOD 水平均明顯升高(P<0.05)。 見圖 4。

圖4 各組小鼠腎組織氧化應激水平的比較Note. A, Normal control group. B, Model group. C, Antagomir-NC group. D, Antagomir-122 group.Figure 4 Comparison of oxidative stress levels in kidney of mice in each group

2.5 各組小鼠腎組織α-SMA、fibronectin 蛋白表達水平的比較

與正常對照組比較,模型組小鼠腎組織α-SMA、fibronectin 蛋白表達水平均明顯增高(P<0.05);模型組與antagomir-NC 組比較,各項指標差異無統計學意義(P>0.05);與antagomir-NC 組比較,antagomir-122 組小鼠腎組織 α-SMA、fibronectin蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。 見圖5。

圖5 各組小鼠腎組織α-SMA、fibronectin 蛋白表達水平的比較Note. A, Normal control group. B, Model group. C, Antagomir-NC group. D, Antagomir-122 group.Figure 5 Comparison of the expression levels of α-SMA and fibronectin in renal tissues of mice in each group

3 討論

DN 是糖尿病患者晚期的一個主要并發癥,以腎小球硬化和腎小管間質纖維化為主要病理特點,據研究報道,至少大約1/3 的1 型糖尿病和1/2 的2型糖尿病會出現不同程度的腎功能不全,是終末期腎疾病的主要原因[9]。 DN 發生發展進展復雜,涉及多種基因的異常表達和多種信號通路的異常改變,至今尚不完全明確[10]。 研究證據表明,miR-31[11]、miR-124a[12]、miR-320a[13]等許多 miRNA 在DN 中異常表達,這些異常表達的miRNAs 及其靶基因在DN 發病機制中起著重要作用[14],為DN 的靶向治療提供了新的研究方向。 文獻報道miR-122 在DN 患者血清中表達升高,并且患者腎功能密切相關[5],但具體作用機制尚不清楚。 為了研究miR-122 在DN 中可能的作用機制,本研究采用目前國內外常用的STZ 腹腔注射聯合高糖高脂飲食的方法建立小鼠DN 模型,我們發現模型組小鼠腎組織中miR-122 表達水平較正常對照組明顯升高。 我們通過給予小鼠尾靜脈注射antagomir-122,抑制DN 小鼠腎組織中miR-122 的表達,結果顯示,隨著DN 小鼠腎組織中miR-122 表達的降低,antagomir-122 組小鼠腎小球硬化評分、血清 Cr、BUN 水平、24 h 尿蛋白定量水平明顯降低,提示沉默miR-122 表達能夠對DN 小鼠腎組織起到明顯的保護作用。

氧化應激是病理狀態下機體的抗氧化系統被抑制,過量的ROS 聚積而無法及時清除,導致脂質過氧化和蛋白質變性,從而導致炎癥反應、腎小球肥大硬化和腎纖維化。 氧化應激是DN 的發病發展的重要機制之一,抗氧化治療在DN 的防治中有著廣泛的前景[15-16]。 MDA 是組織細胞過氧化損傷過程中的中間產物,可以反映出細胞的氧化損傷程度,MDA 水平檢測可以有效反應機體的氧化應激水平[17]。 GSH-Px 和SOD 是氧化應激反應中重要抗氧化酶,其水平可以反應出細胞對氧自由基的清除能力[18]。 研究中我們也發現,與正常對照組比較,模型組腎組織MDA 水平明顯增高,GSH-Px 和SOD水平明顯降低,提示氧化應激在DN 發生進展中發揮重要作用。 進一步我們發現,與antagomir-NC 組比較,antagomir-122 組小鼠腎組織MDA 水平明顯降低,腎組織GSH-Px 和SOD 水平明顯升高,提示沉默miR-122 表達能夠減輕DN 小鼠腎組織的氧化應激從而起到保護作用。 α-SMA、fibronectin 蛋白異常增高是反應腎纖維化程度的標志性蛋白[19],研究中我們發現,與正常對照組比較,模型組小鼠腎組織α-SMA、fibronectin 蛋白表達水平均明顯增高,提示DN 小鼠腎組織存在明顯纖維化。 進一步我們發現,與antagomir-NC 組比較,antagomir-122 組小鼠腎組織α-SMA、fibronectin 蛋白表達水平均明顯降低,提示沉默miR-122 表達能夠減輕DN 小鼠腎組織的纖維化。

Sirt1 是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙酰化酶,屬于Sirtunis 家族之一,在腎小管上皮細胞中表達較高[20]。 Sirt1 在DN 發生進展中作用的研究較多,Sirt1 能夠通過抗氧化應激、抗纖維化、抗炎及調控自噬從而對DN 的產生保護作用已經得到公認[21]。 本研究中我們也發現,與正常對照組比較,模型組小鼠腎組織Sirt1 蛋白表達水平明顯降低。 近期研究發現,miR-122 能夠靶向調控Sirt1 參與機體多種重要的生理活動[22-23],為了探討miR-122 對DN 影響是否與Sirt1 有關,我們通過研究發現,與antagomir-NC 組比較,antagomir-122 組小鼠腎組織Sirt1 蛋白表達水平明顯升高,提示沉默miR-122 表達對DN 小鼠腎組織的保護作用可能與其對Sirt1 的調控有關。

總之,miR-122 在DN 小鼠腎組織中表達升高。沉默miR-122 能夠通過抗氧化應激和纖維化對DN小鼠腎組織起到明顯的保護作用,其機制可能與其調控Sirt1 有關,為DN 的治療提供新的研究方向。