齊墩果酸類似物合成及其體外抗腫瘤活性研究

周 穎， 孟艷秋

(沈陽化工大學 制藥與生物工程學院， 遼寧 沈陽 110142)

齊墩果酸(oleanolic acid,OA)是一種常見的五環三萜類天然產物，具有廣泛的生物活性，并具有保肝、降糖降脂、抗腫瘤、抗HIV等作用[1-6].但由于其水溶性差、生物利用度低、活性不高，因而限制了其在臨床方面的應用.齊墩果酸的結構改造方法主要是圍繞著C-3位羥基和C-28位羧基等官能團的結構修飾，從而合成一系列齊墩果酸衍生物.我們課題組自2000年以來，利用CADD對化合物與蛋白靶點的結合過程進行模擬和解析，對熊果酸、齊墩果酸、積雪草酸等五環三萜衍生物進行半合成，并已取得一定的進展[7-10].

尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)簡稱纖溶酶.纖溶酶通過破壞細胞的結構來介導細胞入侵細胞基質，參與細胞的入侵和組織重塑，包括傷口修復、骨修復重建、血管生成、腫瘤的生長和擴散等重要過程，纖維蛋白溶解系統在惡性腫瘤的浸潤和轉移過程中可能起著非常重要的作用[11].腫瘤是嚴重危害人類健康的疾病.研究表明，實體瘤周圍環境中的胞外基質蛋白、浸潤性免疫細胞和間充質細胞分泌的蛋白質組等均與腫瘤的發生、發展以及腫瘤治療的耐受性等密切相關.腫瘤微環境中一個重要調控因子——纖溶酶原激活物抑制劑1 (plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)，不僅與組織型纖溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activators，tPA)構成調節纖溶活性的一對關鍵物質，而且參與腫瘤的侵襲、浸潤和轉移等多個環節，并扮演重要角色[12].

結合PDB數據庫中纖溶酶受體的三維晶體結構(PDB:2VNT),運用分子模擬對接方法分析了已知2VNT受體小分子抑制劑與靶酶的相互作用,解析靶蛋白發揮活性作用的關鍵氨基酸殘基片段,確定能夠與關鍵位點結合的活性基團,并將部分抑制劑結構中的活性基團片段創新性地引入到五環三萜母體中,主要結構改造集中在2位，引入相應活性基團[13].設計合成5個新型齊墩果酸類似物，并進行體外抗腫瘤活性測試.新合成的齊墩果酸類似物抗腫瘤活性明顯高于母體化合物，值得進一步研究.

1 目標化合物的計設

CADD模擬技術在最近幾年得到了迅猛發展，其能夠優化設計先導化合物、進行多維模擬對接、建立藥效團模型，使其在新藥研發中發揮越來越重要的作用.采用分子對接方法模擬發現齊墩果酸與尿激酶型纖溶酶原激活物抑制受體(PDB編號：2VNT)中的配體(如圖1)的胍基可以連接到齊墩果酸C-28位.因此，本文選用胍基為藥效基團，以課題組前期研究方向為導向設計了下述化合物，對化合物進行計算機虛擬篩選、構效關系及體內外活性等進行評價(如圖2).首先，將3-位羥基氧化為羰基，28-位羧基連接上胍基；其次，A環2-位生成羥亞甲基，再與苯胺反應得到化合物(如圖3)，以期找到抗腫瘤活性好的化合物.

圖1 2VNT配體

圖2 2VNT配體及目標化合物活性口袋和相互作用平面圖

圖3 新型齊墩果酸衍生物設計分析圖

采用分子對接方法模擬發現,齊墩果酸衍生物OA-3、OA-4、Ⅰ1～Ⅰ3(見圖4)與尿激酶型纖溶酶原激活物抑制受體(PDB編號：2VNT)都有較強的親和能力.利用軟件MVD預測并計算蛋白質與化合物的相互作用和能量，通過函數打分的形式將結果用數值來直觀表達，分數表示結合自由能(escore).MVD評估2VNT與目標化合物之間的連接情況如表1所示.能量分數的絕對值越大，結合能力越強.結合分數顯示:化合物Ⅰ1與受體(2VNT)的結合能力為-105.036,化合物Ⅰ3與受體(2VNT)的結合能力為-114.987,自身小分子配體與受體(2VNT)的結合能力為-100.450.化合物Ⅰ1和化合物Ⅰ3表現出與受體(2VNT)有較強的結合能力，值得進一步研究.

表1 纖溶酶與不同化合物能量評分的比較

2 實驗部分

2.1 實驗儀器

ARX-600型核磁共振分析儀，Bruker公司生產; LCQ型質譜儀，菲尼根公司生產； B-540熔點測定儀、V-855真空控制器、R-200旋轉蒸發儀，Büchi公司生產； FD-5N冷凍干燥機，EYELA生產； DZF-6020真空干燥箱，上海精宏公司生產; DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱、TGL-16B低速臺式離心機，浙江鞏義予華公司生產； MCO-15AC CO2恒溫培養箱，三洋公司生產； HPG-280BX光照培養箱，南京維美特科學儀器有限公司生產； SPECTRA MAX plus型酶標儀，美谷分子儀器(上海)有限公司生產； XDS-1B倒置顯微鏡，武漢提沃克科技有限公司生產； LDZX-40SBI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器，上海楚工實業有限公司生產； SB-5200D超聲波清洗機，江蘇迅迪儀器科技有限公司生產.

2.2 合成路線

先將齊墩果酸3位羥基氧化成羰基，得到3-羰基-齊墩果烷型-12-烯-28-羧酸(OA-1)，在此基礎上，將28位的羧基連酰氯，得到3-羰基-齊墩果烷型-12-烯-28-酰氯(OA-2)后，在28位連上胍基，得到3-羰基-齊墩果烷型-12-烯-28-酰胺胍(OA-3)，然后與甲酸乙酯反應，在堿性條件下反應12 h，得到2-羥亞甲基-3-羰基-齊墩果烷-12-烯-28-酰胺胍(OA-4)，在2位上進一步引入苯胺，形成2-苯胺亞甲基-3-羰基-齊墩果烷-12-烯-28-酰胺胍類化合物Ⅰ1～Ⅰ3.目標化合物路線如圖4.

圖4 合成路線

2.3 目標化合物合成

2.3.1 3-羰基-齊墩果烷型-12-烯-28-羧酸(OA-1)的制備

取OA(5.00 g,11.00 mmol)溶于丙酮(250 mL)中，冰浴下緩慢滴加新配制的Jones′試劑(500滴)，10 min后撤去冰浴，并在室溫下反應2.5 h，TLC跟蹤檢測終點[展開劑：V(丙酮)/V(石油醚)=1/5]，體積分數為10 %的硫酸乙醇溶液顯色.反應結束后淬滅，加入異丙醇室溫攪拌45 min.減壓蒸餾除丙酮和異丙醇，加入乙酸乙酯和飽和食鹽水萃取，收集上層乙酸乙酯.加入無水Na2SO4和無水MgSO4混合干燥4 h，過濾，減壓蒸餾濃縮,放入真空干燥箱60 ℃烘干，得粗品4.86 g，其為白色粉末狀固體，產率96.9 %，mp 219.5～222.5 ℃.

2.3.2 3-羰基-齊墩果烷型-12-烯-28-酰氯(OA-2)的制備

取OA-1(4.86 g,10.68 mmol)，加入經無水處理后的DCM(200 mL)，攪拌溶解后加入草酰氯(1.40 mL，12.00 mmol)，加熱回流，TLC檢測[展開劑：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/5]，顯色劑為體積分數為10 %的硫酸乙醇溶液.待反應完畢后，除干后的殘余物中加入環己烷反復旋蒸3次，每次加入環己烷150 mL.減壓蒸餾濃縮,放入真空干燥箱60 ℃烘干，得白色固體3.60 g(7.60 mol)，產率69.2 %，mp 124.4～126.7 ℃.

2.3.3 3-羰基-齊墩果烷型-12-烯-28-酰胺胍(OA-3)的制備

取鹽酸胍(1.10 g，12.00 mmol)，溶于150 mL甲醇溶液中，攪拌溶解后加入KOH(0.70 g，12.00 mmol),反應5～10 min后對溶液進行抽濾，抽濾結束后將甲醇旋蒸.烘干后得到游離胍，其性狀為白色塊狀固體.取中間體OA-2(3.60 g,7.60 mmol)充分溶于150 mL無水二氯甲烷中，加入游離胍1.00 g，待充分溶解后加入吡啶(10 mL)、DMAP(0.20 g,1.60 mmol)，TLC檢測[展開劑：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/5].反應結束后，用乙酸乙酯和飽和食鹽水萃取3次，收集上層乙酸乙酯.加入無水Na2SO4干燥4 h，抽濾，蒸餾除溶劑，放入真空干燥箱60 ℃烘干，得3.276 g白色片狀固體OA-3，產率89.0 %，mp 208.3～209.5 ℃.

2.3.4 2-羥亞甲基-3-羰基-齊墩果烷-12-烯-28-酰胺胍(OA-4)的制備

取上一步中間體OA-3(3.276 g,6.552 mmol)，溶于100 mL無水甲苯溶液中，冰浴下加入叔丁醇鉀(3.00 g，26.80 mmol),并緩慢滴加10 mL甲酸乙酯，20 min后將溫度升為室溫，反應12 h，TLC檢測反應終點[展開劑：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/5]，顯色劑為體積分數為10 %的硫酸乙醇溶液.反應結束后，減壓蒸餾除甲醇溶劑，得淡黃色油狀物，先用稀鹽酸調pH后，加入乙酸乙酯和飽和食鹽水萃取3次，留乙酸乙酯層.加入無水Na2SO4和無水MgSO4混合干燥4 h，過濾，減壓蒸餾除溶劑，放入真空干燥箱60 ℃烘干，得2.498 g淡黃色片狀固體OA-4，產率76.25 %，mp 195.5～197.6 ℃.

2.3.5 2-間氯苯胺亞甲基-3-羰基-齊墩果烷-12-烯-28-酰胺胍(Ⅰ1)的制備

取上一步中間體OA-4(0.400 g,0.75 mmol)，溶解于15 mL無水乙醇中，并加入0.80 mL間氯苯胺(0.87 g,9.34 mmol)溶液，加熱回流，TLC檢測[展開劑：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/5]，顯色劑為體積分數為10 %的硫酸乙醇溶液，4 h反應結束.加入乙酸乙酯和飽和食鹽水萃取3次，留乙酸乙酯層.加入無水Na2SO4干燥4 h，過濾，減壓蒸餾除溶劑，放入真空干燥箱60 ℃烘干.粗品經硅膠柱色譜純化[洗脫劑：V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=40/1]，得0.275 g淡黃色粉末狀固體Ⅰ1，產率70.0 %，mp 200.9～203.3 ℃.

2.3.6 2-間氟苯胺亞甲基-3-羰基-齊墩果烷型-12-烯-28-酰胺胍(Ⅰ2)的制備

按照Ⅰ1的制備方法，由中間體OA-4(0.400 g,0.75 mmol)與間氟苯胺(0.80 mL，4.95 mmol)反應，得0.261 g白色粉末狀固體Ⅰ2，產率69.8 %，mp 212.3～213.9 ℃.

2.3.7 2-間甲氧基苯胺亞甲基-3-羰基-齊墩果烷型-12-烯-28-酰胺胍(Ⅰ3)的制備

按照Ⅰ1的制備方法，由中間體OA-4(0.400 g,0.75 mmol)與間甲氧基苯胺(1.00 g,11.23 mmol)反應，得到0.259 g白色粉末狀固體Ⅰ3,產率65.3 %，mp 221.4～224.0 ℃.

2.4 初步體外活性測試

采用MTT比色法對合成的目標化合物進行體外抗腫瘤活性測試.選擇人肺癌A549細胞和人胃癌SGC7901細胞為靶細胞，以阿霉素和吉非替尼為陽性對照.取體積分數為0.25 %的胰酶適度消化單層培養的細胞，用體積分數為10 %的胎牛血清細胞培養液調整細胞濃度至細胞數為每毫升2×104～4×104的單細胞懸液，接種于多孔平行培養板內.多孔平行培養板在CO2恒溫培養箱中培養，在體積分數為5 %CO2、37 ℃及飽和空氣濕度下培養，待細胞貼壁后，給藥組加入含有不同濃度(將起始質量濃度為1000 mg/L的藥品依次稀釋成500 mg/L、50 mg/L、5 mg/L、0.5 mg/L、0.05 mg/L)的測試物，至少3個平行孔，實驗的空白對照組繼續放入CO2培養箱培養72 h.然后每孔加入50 μL MTT溶液,37 ℃繼續培養4 h.離心除去上清液，每孔加入150 μL DMSO溶解甲臜顆粒，震蕩溶解.在酶聯免疫吸附檢測儀波長為490 nm條件下測定光密度值(OD)，計算所合成化合物對細胞的抑制率和IC50值.

抑制率=

3 結果與討論

3.1 目標化合物的表征

以OA為原料，設計并合成了兩類共5個化合物，即合成了5個新的齊墩果酸類似物，其結構經過NMR確證(如表2).

表2 目標化合物核磁數據

3.2 生物活性評價

采用MTT比色法對合成的目標化合物進行體外抗腫瘤活性測試.選擇人肺癌A549細胞和人胃癌SGC7901細胞為靶細胞，以多柔比星和吉非替尼為陽性對照，計算所合成化合物對細胞的抑制率和IC50值,實驗結果見表3.結果表明，在齊墩果酸母體中引入胍基可以顯著提高其抗腫瘤活性.這對齊墩果酸類似物進行進一步的藥理研究及其衍生物結構設計和優化具有一定的參考價值.

表3 靶化合物對SGC7901和A549細胞增殖的抑制活性

4 結 論

運用CADD分析已知抗腫瘤靶點纖溶酶受體和抑制劑相互作用，設計了5個新的OA衍生物目標化合物，將其與纖溶酶受體蛋白對接，并用MVD計算預測合成的所有化合物與纖溶酶受體蛋白的結合情況.結果表明，合成的化合物與纖溶酶受體蛋白均具有良好的結合能力.經化學合成得到5個新的OA衍生物，目標化合物結構經NMR確認.同時，體外藥理實驗表明，所合成的化合物對人肺癌A549細胞和人胃癌SGC7901細胞均具有抑制活性.初步構效關系表明，在齊墩果酸的2位引入苯胺亞甲基可增強活性，C-28位胍基化也具有一定的增強活性的作用，且苯環上的吸電子基團不利于抗腫瘤活性(Ⅰ1>Ⅰ3>Ⅰ2).其中Ⅰ1和Ⅰ3對人肺癌A549細胞的IC50值分別為5.77 μmol/L、8.01 μmol/L，對人胃癌SGC7901細胞的IC50值分別為4.46 μmol/L、4.72 μmol/L，對腫瘤細胞顯示出較強的抑制作用.纖溶酶體蛋白抑制實驗表明，化合物Ⅰ3對纖溶酶受體表現出較強的抑制活性.本研究結果對進一步優化設計齊墩果酸衍生物作為纖溶酶受體抑制劑的研究具有參考價值.此外計算機輔助藥物設計方法顯示，目標化合物與受體蛋白2VNT結合能力強弱基本與纖溶酶受體抑制實驗顯示的抑制活性一致，表明計算機輔助藥物設計方法在新藥發現與開發中的研究具有參考價值.