不同劑量紅花黃色素A對膿毒癥大鼠炎性因子的影響及急性肺損傷的保護作用

李秋宇,金醒昉,朱惠容,李京輝

(1.昆明醫科大學附屬延安醫院重癥醫學科，云南 昆明 650051；2.昆明醫科大學附屬延安醫院全科醫學科，云南 昆明 650051；3.昆明醫科大學附屬延安醫院病理科，云南 昆明 650051)

膿毒癥(sepsis)是由感染導致的全身炎性反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，可發展為膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS),并進一步發展為多器官功能衰竭(multiple organ failure，MOF)。在膿毒癥諸多易受損器官中 ，肺臟是膿毒癥是最易被攻擊的靶器官 ，患者常較早并發急性呼吸窘迫綜合征(acute respir‐ atory distress syndrome ，ARDS) ，是膿毒癥患者死亡的主要原因之一[1]。近年來，研究發現膿毒癥患者的共同病理生理特征使一系列炎性細胞被相繼激活[2]，炎性反應通過多種分子和細胞機制促進凝血活化，炎性反應和凝血之間的反饋作用加劇了器官功能障礙。現代研究表明，紅花黃色素具有擴張血管、改善心肌供血、明顯抑制ADP誘導的家兔血小板聚集[3]、抗炎作用等多種藥理作用，適用于冠心病、血管栓塞性疾病、高血壓、糖尿病并發癥等疾病[4]。因此本實驗再次深入研究膿毒癥導致大鼠早期ARDS時不同劑量紅花黃色素A對大鼠血清中細胞因子和肺部功能的影響，希望能給膿毒癥治療提供更多實驗室依據。

1 資料與方法

1.1實驗動物：本次實驗經過本院醫學倫理委員會同意，取健康SD大鼠195只，雌雄不拘，體重140～224 g(昆明醫科大學實驗動物中心提供)，于實驗室飼養(通風向陽，自由飲水，新鮮飼料，溫度20～22℃，濕度50%～55%)。

1.2實驗方法

1.2.1動物模型制備：清潔級雌雄不拘SD大鼠，體重 140～224 g。適應性飼養1周后，按照Rittirsch等報告的方法行CLP，復制嚴重腹腔感染致大鼠膿毒癥模型[5]。術前禁食12 h，可以自由飲水。以3%戊巴比妥腹腔注射(0.12 ml/kg體重)麻醉，大鼠麻醉后，腹正中線切口，結扎暴露的盲腸根部(避免結扎回盲部腸系膜血管)，用16號穿刺針貫通穿刺盲腸2次形成腸瘺，并輕輕擠壓讓小量大便進入腹腔。將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口，術畢皮下立即注射10 ml生理鹽水，抗休克，給自由飲水。

1.2.2動物的分組及處理：SD大鼠195只，雌雄隨機分成5個大組，細分13個小組，每組15只：正常對照組、手術組(模型組)、手術組+紅花黃色素A 20 mg/kg組、手術+紅花黃色素A 40 mg/kg組、手術+紅花黃色素A 60 mg/kg組，后四組再按處死大鼠時間分為手術后6 h組、12 h組、24 h組三組。紅花黃色素A各組于CLP后立即將注射用紅花黃色素(浙江永寧藥業股份有限公司，國藥準字：20050148)20 mg/kg、40 mg/kg、60 mg/kg稀釋至1 ml進行腹腔注射，而給予手術組等量生理鹽水，繼而將大鼠按相應時間點麻醉后, 經腹主動脈無菌采血，采集肺部標本。送檢各項目的測試。

1.3標本采集及處理

1.3.1血標本的采集與處理：將動物按相應時間點麻醉后，經腹主動脈無菌采血，留取1 ml立即送檢動脈血氣分析，留取3 ml血于含有3.8%枸櫞酸鈉的試管內，分離血漿于-80℃保存待用。

1.3.2留取標本用動脈血氣分析儀檢測氧分壓：用大鼠APC酶聯免疫吸附法(ELISA ) [江萊化學科技(上海)有限公司]檢查白介素-1β(IL-1β)，腫瘤壞死因子(TNF-α)，血清組織因子(TF)及組織因子途徑抑制物(TFPI)。

1.3.3支氣管肺泡灌洗液細胞計數分類：將支氣管肺泡灌洗液離心，獲得的細胞沉渣懸浮于0.2 ml鹽水中，涂片，離心，瑞-吉染液染色，在40倍光鏡下分類計數玻片上每200個細胞中的中性粒細胞。

1.3.4肺部病理切片制作： 大鼠處死后，立即取左下肺肺葉，取0.9%生理鹽水沖洗干凈血漬，放置固定液中，送本院病理實驗室進行固定，脫水，浸蠟，包埋，切片，然后由病理實驗室醫師出片報告。

2 結果

2.1各組大鼠血清中 TNF-α、IL-1β、TF、TFPI表達含量：IL-1β：CLP各時間組、CLP+紅花黃色素A低劑量6 h組、12 h組和中、高劑量6 h組較正常組升高明顯，差異有統計學意義(P<0.05)， CLP+紅花黃色素A低劑量24 h組、中劑量12 h組、24 h組和高劑量6 h組、12 h組、24 h組較CLP相同時間組下降差異有統計學意義(P<0.05)。CLP+高劑量6 h較低低劑量6 h組下降明顯 (P<0.05)。說明紅花黃色素A對白介素-1β有下調作用，但低劑量組時下降不明顯，反而到中-高劑量組效果才明顯。見表1。

TNF-α：CLP組與紅花黃色素A各劑量組較正常組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。同一時間段CLP+紅花黃色素A中劑量12 h組、24 h組和高劑量6 h組、12 h組、24 h組的比CLP組相同時間段比較明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)，中-高劑量組顯著下降，差異有統計學意義(P<0.01)，說明紅花黃色素可以顯著減少膿毒癥時TNF-α的釋放。而且與劑量有關。見表1。

TF：CLP組和CLP+紅花黃色素A各劑組較正常組顯著升高(P<0.05)，CLP+紅花黃色素A低、中劑量的12 h組，24 h組及高劑量的6 h組、12 h組、24 h組較CLP組相同時間段下降明顯，差異有統計學意義(P<0.05) ，CLP+紅花黃色素A相同時間段不同劑量組之間相比較，高劑量組6 h組、24 h組較低劑量相同時間段有明顯差異，說明對于下調組織因子小劑量的紅花黃色素A12 h就已經有效，但高劑量效果更明顯。見表1。

TFPI：與正常組相較CLP+紅花黃色素A各劑量組升高明顯，差異有統計學意義(P<0.05)， CLP+紅花黃色素A各劑量12 h組、24 h組較相同時間段的CLP組升高明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。說明紅花黃色素對組織因子途徑抑制物有增強調節作用，在低劑量12 h就有增強作用，到24 h時增強最明顯。見表1。

表1 各組大鼠血清中 TNF-α,IL-1β，TF，TFPI表達含量

2.2各組大鼠動脈血氧分壓(mm Hg)比較：與正常組比CLP組和紅花黃色素A各劑量組PaO2顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，CLP+紅花黃色素A各劑量組與CLP組相同時間段比較，血氧分壓均改善，差異有統計學意義(P<0.05)，CLP+紅花黃色素A相同時間段不同劑量組之間相較：高劑量組較低劑量組有改善，高劑量6 h組、24 h組較低劑量組血氧分壓明顯改善，差異有統計學意義(P<0.05)，說明低劑量的紅花黃色素A已經有改善氧和的作用，只是高劑量的紅花黃色素A 改善血氧含量的功效強于低劑量組。見表2。

表2 大鼠動脈血氧分壓

2.3各組大鼠氧合指數比較：與正常組比CLP組和紅花黃色素A各劑組氧合指數顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，CLP+紅花黃色素A各劑量組與CLP組相同時間段比較氧合指數改善，差異有統計學意義(P<0.05)，CLP+紅花黃色素A相同時間段不同劑量組之間相較，高劑量12 h組、24 h組較低劑量組氧合指數明顯，差異有統計學意義(P<0.05)，說明低劑量的紅花黃色素A已經有改善氧和指數的作用，只是高劑量的紅花黃色素A 改善血氧含量的功效強于低劑量組。見表3。

表3 大鼠氧合指數

2.4各組大鼠肺支氣管肺泡灌洗液中中性粒細胞計數：與正常組比CLP組和紅花黃色素A各劑組顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，CLP+紅花黃色素A各劑量組與CLP組相同時間段比較中性粒細胞計數明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)，CLP+紅花黃色素A相同時間段不同劑量組之間相較，高劑量組較低劑量組有改善明，差異有統計學意義(P<0.05)，說明低劑量的紅花黃色素A已經有減少中性粒細胞炎性聚集是作用，只是高劑量的紅花黃色素A 改善炎性反應功效強于低劑量組。見表4。

表4 大鼠肺支氣管肺泡灌洗液中中性粒細胞計數

2.5各組光鏡下大鼠肺組織病理表現(HE×40倍)比較：正常組肺組織病理切片肺組織結構完整清晰，肺泡壁光滑薄，肺泡間隔一致、均勻，CLP 6 h炎性病變重度、肺間質中度水腫，肺間質內及肺泡腔見中度淤血。CLP+紅花黃色素A 6 h炎性病變中度、肺間質中度水腫，肺泡腔內見中-輕度淤血。CLP 12 h組炎性病變重度、肺間質中度水腫，部分肺泡腔變窄或消失，肺間質及肺泡腔內見中度淤血。CLP+紅花黃色素A 12 h肺泡壁增厚、肺泡腔變窄、腔內可見炎性細胞浸潤，肺間質充血、水腫，可見局部肺氣腫并灶狀炎性細胞浸潤。CLP 24 h肺泡壁明顯增厚，肺泡腔變窄或消失,肺間質增寬，腔內可見炎性細胞明顯增多，肺間質水腫、充血, 可見肺氣腫伴局灶性肺不張并炎性細胞彌漫性浸潤，CLP+紅花黃色素A 24 h組肺泡壁變薄，肺泡腔變窄，腔內可見炎性細胞浸潤，肺間質充血、水腫，可見局部肺氣腫并灶狀炎性細胞浸潤。紅花黃色素A治療后肺部組織的病變較CLP相同時間段組明顯緩解。見圖1。

注：A:正常肺組織；B: CLP6h組肺組織；C: CLP+紅花黃色素A 6 h組肺組織；D: CLP 12 h組肺組織；E: CLP+紅花黃色素A 12 h組大鼠肺組織；F: CLP 24 h組肺組織；G: CLP+紅花黃色素A 24 h組肺組織

3 討論

膿毒癥是臨床中極為常見的一種病情兇險、病死率高的綜合征。膿毒癥時各炎性因子和炎性細胞共同構成一個復雜的炎性系統，相互協同或彼此拮抗，一旦機體炎性細胞免疫平衡被打破，則發生炎性介質大量釋放，導致全身靶器官組織的損傷，其中首先累及的臟器是肺，最早、最常見的并發癥是ALI/ARDS(急性肺損傷/呼吸窘迫綜合征)，也是膿毒癥患者直接死亡的原因之一。既往關于膿毒癥ARDS在動物實驗方面進行了大量的基礎研究[6]，已有部分指標如TNF-α、IL-10、IL-6應用于臨床，作為膿毒癥ARDS早期預警生物標志物之一指導其早期診斷和治療。近年來，膿毒癥導致的急性肺損傷主要還是在積極治療膿毒癥的同時給予呼吸機機械通氣治療，但病死率仍高達30%～70%[7]，因此本實驗再次深入研究膿毒癥導致大鼠ALI/ARDS時不同劑量紅花黃色素A對肺部炎性反應的控制和肺部功能的改善，希望能給膿毒癥治療提供實驗室依據。

肺部生理解剖結構顯示，肺是唯一接受全部心排血量的器官 ，有著豐富的毛細血管網。肺血管內皮細胞在局部炎性反應中起著積極主動的作用，肺巨噬細胞釋放一系列損傷性炎性介質，是肺局部趨化因子的主要來源，可引起中性粒細胞等在肺臟的聚集造成損傷[8]，同時肺內過度活化的炎性反應，最終出現肺部廣泛的滲出，肺間質及肺泡水腫，氧交換發生障礙，發生ALI /ARDS[9]。因此，在膿毒癥中肺臟是最早受累的靶器官，其急性肺損傷 (ALI)出現得最早且發生率最高。

紅花是中醫治療中常用的中藥之一，在很多驗方中都是主要成分。由紅花中提取的注射用紅花黃色素主要成分是紅花黃色素A，現代研究發現它有降低白細胞黏滯及抗血小板集聚功能[10]，故而對抗凝血和改善循環，改善器官供血[11]降血壓、改善心肌缺血[12-13]，降血脂[14]，抑制細胞凋亡從而保護大鼠大腦缺血再灌注的損傷[15]，抗氧化[16]提高機體耐受缺氧的能力[17]抗炎作用，保護脂多糖導致的大鼠急性肺損傷的炎性因子有明顯的抑制作用[18]等廣泛的藥理作用。

本研究通過觀察SD大鼠盲腸結扎穿孔(CLP)建立膿毒癥模型。同時給予不同劑量的紅花黃色素A注射液治療發現，紅花黃色素A可以改善大鼠膿毒癥時炎性因子的表達，明顯降低血清TF、IL-1β、TNF-α表達水平，使血清TFPI表達水平升高，符合之前研究[19]。同時觀察到大鼠膿毒癥發生ALI/ARDS時，紅花黃色素治療組大鼠肺組織的損傷較CLP組減輕，符合紅花黃色素A可下調炎性因子水平的研究，說明紅花黃色素可減輕膿毒癥時炎性因子的促進作用，減緩器官功能障礙綜合征的發生，對膿毒癥時的肺損傷有保護作用，這與紅花黃色素A可以抑制膿毒癥大鼠肺組織的炎性因子和中性粒細胞增加的作用有明顯關系。

總之，膿毒癥的發病機制復雜多變，涉及多臟器，特別是一開始就傷及肺臟，可以引起炎性失控、免疫功能紊亂、凝血障礙等一系列問題，本研究結果說明，給予較大劑量紅花黃色素A治療能夠顯著改善膿毒癥大鼠的肺功能，改善氧和指數，明顯減低促炎因子的表達，增加抗炎因子的釋放，并且具有保護大鼠凝血功能[19]、調節促炎/抗炎平衡、保護肺功能，故可以考慮在膿毒癥早期有凝血功能障礙及ALI/ARDS時選擇使用。