地黃促生內生尖孢鐮刀菌GG22基因組結構分析

朱畇昊　彭淑萍　趙樂　董誠明

摘要：通過高通量測序分析1株能夠促進地黃生長及次生代謝產物積累的內生尖孢鐮刀菌的基因組結構，推測其內生及促生機制。使用Illumina Hiseq X ten雙端測序技術對內生真菌GG22進行基因組測序，并進行生物信息學分析。分析結果，共得到17 296個預測的基因，其中基因的總長度26 937 813 bp，平均基因長度為1 557.4 bp。與KOG、KEGG、Swiss-Prot、TrEMBL、Nr及Pfam常用功能數據庫進行BLAST比對，共有17 202個基因得到功能注釋，注釋率為99.46%，其中有3 801個基因注釋到KEGG數據庫中;7 431個基因注釋到KOG數據庫中;11 548個基因注釋到 Pfam 數據庫中;9 007個基因注釋到 Swissprot數據庫中;17 201個基因注釋到TrEMBL數據庫中，且分別有881、5 247、158個基因被注釋到CAZyme、PHI、TCDB數據庫。基因功能分類分析發現，尖孢鐮刀菌GG22的細胞運動和細胞外結構不發達，這可能是其成為地黃塊根寄生內生菌的原因之一。基因簇分析得出，GG22可能能夠產生碧卡維林等化合物而抑制其他微生物的生長，同時保護寄主植物免受其他病原菌的侵害，成為地黃促生內生真菌。通過對GG22基因組結構進行分析，初步獲得了其內生性生物學基礎，為進一步闡明其促進地黃生長及次生代謝產物積累奠定了基礎。

關鍵詞：地黃;內生真菌;尖孢鐮刀菌;基因組;次生代謝

中圖分類號：S567.23+9.01;S182 文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2021）19-0072-06

地黃（Rehmannia glutinosa Libosch）是玄參科地黃屬多年生草本植物，常以干燥塊根入藥，是中醫常用的中藥材之一。筆者所在實驗室前期從野生地黃中分離出1株內生真菌GG22，經鑒定其為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。有研究報道，尖孢鐮刀菌可作為土傳性病原真菌侵染三七[1]、半夏[2]、大黃[3]等多種藥用植物，造成藥用植物的枯萎病或腐爛病，嚴重影響藥材的產量和質量。本研究所使用的GG22為地黃植株內分離獲得的內生真菌，不會引起地黃病害，與地黃共生后能顯著提高地黃的株高、株幅，且可顯著提高地黃植株中次生代謝產物的積累[4]。

近年來，隨著高通量測序技術的發展，多個病原性尖孢鐮刀菌菌株已經完成了基因組測序[5-6]，從基因組水平鑒定獲得了一系列致病相關的基因，為深入研究其致病的分子機制奠定了基礎。GG22作為內生型尖孢鐮刀菌，其基因組結構等信息還未見報道，這已經成為深入了解GG22的內生特性及其與寄主互作的障礙。因此，本研究選取地黃內生尖孢鐮刀菌GG22進行基因組測序并組裝，從基因組結構及基因組成角度，對GG22基因組進行注釋，了解GG22基因組的組成特點，尋找細胞壁降解酶、病原菌-寄主互作相關基因、次生代謝合成相關基因等，分析GG22內生性的遺傳基礎，以期為后續研究GG22促進地黃生長及次生代謝產物合成積累的機制提供良好的基因組學基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

地黃內生真菌GG22保存于4 ℃冰箱。

1.2方法

1.2.1內生真菌GG22的DNA提取2018年12月，于河南中醫藥大學河南省道地藥材生態種植工程技術中心組織實驗室內開展相關試驗。內生真菌GG22接種于PDA固體培養基活化3～4 d。挑取菌絲轉入PDB液體培養基中搖培2～3 d（轉速120 r/min，28 ℃）即得內生真菌GG22的種子液。以2%接種量接種于液體PDA中，培養3～4 d 即可，培養條件同上。過濾得GG22菌絲，洗凈菌絲，立即冷凍送至北京百邁克生物科技有限公司。用試劑盒提取GG22基因組DNA，并檢測濃度及質量。

1.2.2基因組DNA測序及組裝超聲波隨機打斷提取GG22樣品的DNA，獲得插入270 bp的片段，從而構建測序文庫。構建文庫進行橋式 PCR 后，通過Illumina Hiseq X ten雙端測序。SOAP denovo軟件對GG22菌株測序數據進行組裝。

1.2.3基因組組分分析與功能注釋EVM、Augustus、GlimmerHMM及SNAP2.2.2中組裝好的基因組進行預測和整合，其中包括重復序列、編碼基因、非編碼RNA及假基因。所有預測基因的編碼蛋白與KEGG、TrEMBL、Nr等通用功能數據庫和CAZy、PHI等專用功能數據庫做比對，即得基因相關的功能注釋結果。利用SignalP 4.0和TMHMM可在所有預測到的蛋白序列中分別找出含有信號肽的蛋白和跨膜蛋白。利用anti-SMASH對GG22次生代謝產物合成基因簇進行預測。

2結果與分析

2.1基因組測序及組裝

對GG22構建1個270 bp文庫，共得到約 9.04 Gb 的原始數據。測序質量值在30以上的堿基比例不小于94.81%，Contig N90 的長度為 4 629 bp，G+C含量為47.49%。

2.2基因組組分分析

應用EVM、Augustus和GlimmerHMM等軟件進行基因結構預測，共得到17 296個預測的基因，其中基因的總長度26 937 813 bp，平均基因長度為 1 557.4 bp。tRNAscan-SE預測基因組中有52種tRNA，數量為337個;Infernal1.1分析得到159個rRNA，并以其功能進行劃分即分為3類，其他ncRNA有46個，分為33類。在GG22基因序列中利用Gene Wise尋找不成熟的終止密碼子及移碼突變，得到147個假基因，假基因總長度為172 834 bp，平均每個長度1 175.74 bp。

2.3基因組功能注釋

與KOG、KEGG、Swiss-Prot、TrEMBL、Nr及Pfam常用功能數據庫進行BLAST比對，共有17 202個基因得到功能注釋，注釋率為99.46%。其中有 3 801 個基因注釋到KEGG數據庫中;7 431個基因注釋到KOG數據庫中;11 548個基因注釋到 Pfam 數據庫中;9 007個基因注釋到 Swissprot數據庫中;17 201個基因注釋到TrEMBL數據庫中。碳水化合物相關酶數據庫（CAZyme）可對碳水化合物酶類基因進行功能注釋，其中包括供糖類化合物合成、碳水化合物活性酶分解的研究和信息。病原體-宿主互作因子數據庫（Pathogen Host Interactions，簡稱PHI）收錄多數具有毒力和效應基因的細菌、卵菌、真菌及其宿主信息，可從中尋找某菌株中與致病性相關的基因。轉運蛋白分類數據庫（Transporter Classification Database，簡稱TCDB）包含了生物體運輸系統的分類、結構、功能等信息。分別有881、5 247、158個基因被注釋到CAZy、PHI及TCDB這3個數據庫。軟件SignalP 4.0和 tmhmm在所預測到的基因的蛋白序列中，分別找出1 654個含有信號肽的蛋白、3 362個跨膜蛋白及1 238分泌蛋白。

2.3.1KOG注釋從表1可以看出，選擇利用KOGs（EuKaryotic Orthologous Groups）進行基因注釋與功能分類， 共注釋基因7 431個， 可分為25個功能組和4大類，分別為細胞過程及信號、信息儲存及加工、代謝過程、功能特點不明顯，分別注釋基因數為1 660、1 164、2 817、1 736個基因，另有903個基因功能類別未知。尤其注意到的是，尖孢鐮刀菌GG22的功能分類N（細胞運動）和W（細胞外結構），基因數量分別只有3個和8個，相比之下不是很多，可以分析出，尖孢鐮刀菌GG22的細胞運動和細胞外結構不發達，這可能是其成為地黃塊根寄生內生菌的內在原因之一。

2.3.2KEGG注釋KEGG總共注釋得到的物質代謝通路有111個（圖1）。尖孢鐮刀菌GG22中預測代謝通路在新陳代謝、細胞過程、遺傳信息加工和環境信息加工等4大類中涉及的基因比較多。新陳代謝分類中，共有2 576個基因，細胞過程分類中，共有508個基因，遺傳信息加工分類中，共有550個基因，環境信息加工分類中，共有189個。

2.3.3CAZyme注釋真菌可以產生大量的碳水化合物活性酶，而該類物質是與真菌的生活方式可能緊密相關，同時也是真菌降解纖維素、果膠等植物細胞壁成分，從而與植物建立共生或寄生關系的重要酶類系統。CAZymes分為糖苷水解酶類（GHs）、糖基轉移酶類（GTs）、多糖裂解酶類（PLs）、糖酯酶類（CEs）、糖結合模塊（CBMs）等。本研究發現，GG22基因組中，GHs數量最多，共有375個;CEs共有205個;GTs共有121個;碳水CBMs共有118個;PLs共有26個（表2）。

植物的細胞壁是病原菌或內生真菌建立侵染關系的主要障礙，而CEs、PLs和GHs 3個家族的酶類被稱為細胞壁降解酶，這些酶可能有助于真菌侵入宿主細胞，在真菌對于宿主的滲透和成功感染具有重要的作用。這些酶在尖孢鐮刀菌侵染過程中的作用是當前研究的熱門。從表3可以看出，GG22能分泌出幾種不同的細胞壁裂解酶，如角質酶、果膠甲酯酶、果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等，這些酶的發現可為進一步探索GG22的侵染過程奠定基礎。

2.3.4PHI注釋PHI為病原宿主互作數據庫，主要收錄與病原菌相關基因包括致病基因、毒力基因和效應蛋白基因。GG22基因組中有5 247條病原菌-寄主互作（PHI）相關基因，歸屬于90個PHI類型。對GG22基因組中基因缺失后引起真菌毒力增加的PHI類型進行了初步分析（表3），并對包含3條及以上基因的PHI類型進行了總結。PHI：4194共有45條，這些基因的存在可能是GG22維持內生生活的關鍵所在。

2.4次級代謝產物合成基因簇分析

本研究使用anti-SMASH對基因組進行次級代謝產物合成分析預測，基因組中共預測得到42個次級代謝產物基因簇，在預測到的基因簇中，萜烯類基因簇（Terpene）共有10個，占預測總基因數的23.80%;聚酮合酶基因簇（Polyketide synthase，簡稱PKS）共9個，占預測總基因簇的21.42%，其中T1pks含有8個，T3pks含有1個;非核糖體多肽合成酶基因簇（non-ribosomal peptide synthase，簡稱NRPS）共8個，占預測總基因簇的19.04%;T1pks-Nrps混合和吲哚類（Indole）基因簇各有3個，各占預測總基因簇的7.14%;其他類共有9個，占預測總基因數的21.43%（圖2）。

將所有GG22基因簇與已知次級代謝產物基因簇進行BLAST比對發現，從表4可以看出，GG22的基因組中暗示著其具有合成Fusarubin、Alternapyrone等化合物及其衍生物的能力。碧卡維林（Bikaverin）[14]、白僵菌素（Beauvericin）[15]、Aspyridone[16]和Equisetin[17]類化合物都具有一定的抗真菌、細菌、病毒及抑制根結線蟲的能力，而GG22基因組中具有合成上述化合物的相似基因簇，推測GG22可能能夠產生碧卡維林等化合物，從而抑制其他微生物的生長，保護寄主植物免受其他病原菌的侵害，為其寄主提供一定的保護。鐮紅菌素（Fusarubin）類化合物是腐皮鐮刀菌的特征次生代謝產物[18]，也能在腐皮鐮刀菌與某些植物形成互利共生關系的過程中發揮作用。GG22基因組中1個T1pks基因簇（129182-176252）與Fusarubin合成基因組相似度為87%，說明GG22可能也具有合成Fusarubin類化合物的能力，而該類化合物可能與其能夠與植物進行共生有一定的關系。 GG22中含

有合成 alternapyrone 類的相似基因，推測其具有代謝該類化合物的能力，而 alternapyrone 類化合物在相關生物酶作用下進一步合成萘并吡喃酮類化合物的是一種新型昆蟲拒食素[19]。因此，GG22合成alternapyrone可保護其自身及寄主減少昆蟲取食的風險。地普丁（Depudecin）是一種11碳線性聚酮化合物，是組蛋白脫乙酰基酶（HDAC）的抑制，也是病原菌與寄主之間相互作用的毒力因子，但其毒力中的作用較輕[20]。白僵菌素（Beauvericin）[15]和鐮刀菌酸（Fusaric acid）[21]是病原菌產生的非寄主特異性致病毒素，可促進病原菌的侵染。GG22基因組中與白僵菌素和鐮刀菌酸合成基因簇相似度分別為20%、13%，相似度均較低，說明GG22可能具有合成類似化合物的能力，從而幫助自身完成對寄主植物的侵染，但GG22合成的類似化合物其毒力可能較輕，不足以使寄主致病。

根據筆者所在實驗室之前的研究，體外液體培養GG22可以產生GA、IAA等植物激素，從而促進寄主植物的生長及次生代謝產物的積累。本研究在通過KEGG對萜類化合物合成途徑分析時發現，發現在GG22中注釋到參與萜類化合物合成途徑的有32個基因，主要為泛醌和其他萜類醌的生物合成（ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis，ko00130）途徑12個，萜類骨架生物合成（terpenoid backbone biosynthesis，ko00900）途徑18個，但是缺乏二萜類生物合成相關基因。因此，GG22產生二萜類化合物GA的途徑還并不清晰，這可能是與基因組序列拼接長度不夠、注釋不完全有關。在參與IAA生物合成的色氨酸代謝途徑（ko00380）中，共發現57個基因編碼的19個酶參與其中，這些基因可能參與GG22 GA、IAA等植物激素及其類似物的生物合成。

3討論與結論

植物內生真菌是指能在植物組織內部定殖，但不引起寄主產生病害的一類真菌。有些內生真菌能夠通過產生激素、解磷解鉀等方式促進植物生長、提高寄主抗逆性和刺激寄主次生代謝產物合成。很多內生真菌其同種但不同的菌株卻是病原菌，而與病原菌與植物互作相比，內生真菌與植物互作的分子機制還很不清楚。近年來，隨著高通量測序技術的普及， 越來越多的病原真菌基因組被揭示，如稻瘟病菌、玉蜀黍黑粉菌、禾布氏白粉菌等，然而植物內生真菌基因組相關的研究報道還較少。植物病原真菌的全基因組測序分析可以為內生真菌相關研究提供參考。本研究通過對地黃內生真菌GG22進行全基因組測序，拼接得到基因組總長度26 937 813 bp，GC平均含量為47.49%。與KOG、KEGG、Swiss-Prot、TrEMBL、Nr及Pfam常用功能數據庫進行BLAST比對，共有17 202個基因得到功能注釋，注釋率為99.46%，這些基因的注釋為進一步了解GG22的生物學特性提供了基礎數據。

真菌在物質代謝和循環中發揮著至關重要的作用，不同類型真菌具有不同的營養方式，如腐生真菌、寄生（病原）真菌、內生真菌等。真菌可以產生大量的碳水化合物活性酶，該類物質是真菌生長發育過程中極為突出的蛋白家族，與真菌的生活方式可能緊密相關。 萬仁鵬等比較了97株腐生、病原及內生3種不同營養方式的真菌中CAZymes的含量[22]，發現腐生真菌含有的CAZymes最少，僅有200個左右，而內生真菌中約一半含有的CAZymes超過700個。本研究發現，內生尖孢鐮刀菌GG22基因組中共有881個CAZymes，說明CAZymes可能在內生真菌侵染過程中發揮著重要的作用。

病原體寄主互作的相關基因是真菌致病的重要決定因子，基因產物直接體現在病原菌對寄主侵染環境的適應和反應，誘導植株發生病理反應。GG22基因組中有5 247條病原菌-寄主互作（PHI）相關基因，歸屬于90個PHI類型。與其他病原真菌相比，其PHI類型較少，這可能是與其為植物內生真菌，不引起寄主產生病害有關。PHI：4194，PHI：2393等類型基因失活導致病原菌響應寄主致病能力增強，因此推測這些基因在GG22維持生長而不致病的內生生活中發揮著重要的作用。

植物內生真菌能產生非常豐富的次生代謝產物，這些次生代謝產物可能在其生長過程中發揮著一定的作用，其次，內生真菌次生代謝產物很多都具有較好的生物學活性，有些內生真菌甚至能產生與寄主相同或相似的活性物質，這些活性產物可以作為新藥開發重要的化合物庫。GG22基因組中共預測得到42個次級代謝產物基因簇，包括萜烯類基因簇、聚酮合酶基因簇、非核糖體多肽合成酶基因簇、吲哚類基因簇等，暗示著GG22能夠產生多種類型的次生代謝產物，而其可能產生的Fusarubin、Beauvericin 等物質可能對GG22的侵染、建立共生關系、保護寄主植物等發揮著一定的作用。

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基金項目：國家自然科學基金（編號：81603232）;國家重點研發計劃（編號：2017YFC1702800）;河南省科技攻關計劃（編號：172102310539）。

作者簡介：朱畇昊（1986—），男，河南鄭州人，博士，副教授，主要從事藥用植物分子生物學研究。 E-mail：guxinhan123@163.com。

通信作者：董誠明，教授，主要從事中藥材規范化種植研究。E-mail：dcm371@sohu.com。