基于微衛星標記的圖們江大麻哈魚遺傳多樣性分析

閆春梅，鄭偉，高春山，韓葉，李忠強，李秀穎

（吉林省水產科學研究院，長春 吉林 130033）

大麻哈魚Oncorhychus keta 屬鮭形目Salmoniformes 鮭科Salmonidae 太平洋鮭屬Oncorhynchus的冷水性洄游魚類[1]，在中國分布于黑龍江、圖們江、烏蘇里江、松花江、琿春河、密江、綏芬河、嫩江、牡丹江以及臺灣省的大甲溪等水系。水利工程阻礙了大麻哈魚洄游通道，破環了自然產卵場和索餌場，大麻哈魚自然種群數量急劇下降，2007 年被列入《中國國家重點保護經濟水生動植物資源名錄（第一批）》，多年來依靠人工增殖放流補充其自然資源量。近年來，有關大麻哈魚的群體年齡組成及生長性狀[2-4]、繁殖力[5-7]、種群結構[8-11]、生物學性狀[12-14]及放流標記方法[15-17]和放流效果評估[18,19]等已有研究。但人工增殖放流活動對圖們江大麻哈魚野生自然種群的遺傳多樣性和遺傳結構的影響未見報道。

遺傳多樣性及遺傳結構的分析是評估種質資源現狀的主要途徑和種質保護的核心內容，也是增殖放流工作的重要環節，具有重要的作用[20]。用于增殖放流的群體必須具有豐富的遺傳多樣性。在群體遺傳結構和遺傳多樣性分析過程中，微衛星標記法的分辨率高，可以檢測共顯性遺傳，已成為有效的熱門標記手段[21-25]。本實驗利用已發表的10 對微衛星引物[26]，分析了2015、2016、2017 及2018 年在圖們江采捕到的大麻哈魚親魚的遺傳多樣性及遺傳結構，并分析人工增殖放流是否會影響大麻哈魚群體的遺傳多樣性，可為大麻哈魚種質資源保護、恢復大麻哈魚野生自然群體資源量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用大麻哈魚樣品采捕于中國吉林省圖們江流域，總計169 尾，其中2015 年62 尾，2016 年29 尾，2017 年28 尾，2018 年50 尾，分別取鰭條樣本置于95%乙醇中備用。

1.2 基因組DNA 提取

用超純水沖洗鰭條樣本，去除殘余乙醇。晾干后剪碎，按照DNA 提取試劑盒（鼎國昌盛生物公司）說明書提取基因組DNA。經OD260/280分析測定DNA 濃度后，稀釋至100 ng/μL，-20℃保存備用。

1.3 PCR 擴增

本研究所用10 對微衛星引物均由本實驗室開發，引物多態性良好，GenBank 登錄號為MH619620-MH619629（表1）。由上海生物工程有限公司合成熒光引物。PCR 反應體系中含有10×PCR Buffer 1 μL，dNTP 0.2 μL，MgCl20.4 μL，引物各0.2 μL，Ex Taq 酶0.04 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 補足至10 μL。94℃2 min，（94℃30 s，Tm 30 s，72℃30 s）5 個循環，（94℃30 s，50℃30 s，72℃30 s）30 個循環，72℃5 min。應用3730xl 基因分析儀檢測PCR 產物。

表1 引物序列Tab.1 The sequences of primer used in the experiment

1.4 數據分析

所有數據采用PopGen 32 軟件處理，計算等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、香農信息指數（I）、Hardy-Weinberg 平衡檢驗（P）、近交系數（Fis）、分化系數（Fst）和基因流（Nm）。采用PIC-CALC 計算平均多態信息含量（PIC）。

2 結果與分析

2.1 SSR 基因分型結果

利用10 個微衛星位點對169 尾大麻哈魚鰭條樣本進行熒光PCR 反應，產物經毛細血管電泳檢測后，根據熒光標記的顏色，用軟件Genemapper 分析基因型，讀取單個大麻哈魚樣本在各個微衛星位點的基因型片段大小（圖1）。

圖1 大麻哈魚微衛星引物在個體中的等位基因峰圖Fig.1 Electropherogram peaks of microsatellite primers in chum salmon

2.2 遺傳多樣性

應用10 對微衛星引物估算了圖們江大麻哈魚2015、2016、2017 及2018 年4 個群體的Na、Ne、Ho、He、I 和H-W（表2）。由表2 可知，4 個年度群體中共檢測到Na 397 個，Ne 為4.7853～6.1309，Ho 為0.6500～0.7200，He 為0.7663～0.8359，I 為1.8128～1.9836。利用PIC 計算軟件計算群體平均多態信息含量為0.7288～0.8017，均為高度多態（PIC＞0.5）。

表2 4 個年度群體的10 個微衛星位點的遺傳多樣性分析Tab.2 Parameters of genetic diversity analyzed by ten loci in populations of chum salmon in four years

10 對微衛星引物在4 個群體中進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗，所有位點均為多態位點，其中符合H-W 平衡的位點有18 個（P＞0.05），其他22 個位點偏離H-W 平衡（P＜0.05）。

2.3 群體間遺傳結構

2015—2018 四年的大麻哈魚群體的10 個微衛星標記近交系數中，分別有8、7、9、5 個位點為正值，平均值為0.0298～0.1758。通過基因流（Nm）和群體間遺傳分化系數（Fst）分析可知（表3），Nm＜1 的位點0 個，1＜Nm＜4 的位點6 個，其他4 個位點Nm＞4。群體間平均遺傳分化系數為0.0755。

表3 10 個微衛星位點的遺傳分化系數及基因流Tab.3 Fst and gene flow of 10 polymorphic loci

這4 個年度大麻哈魚群體的遺傳相似系數為0.4505～0.8249，其中2015 年和2017 年群體遺傳相似系數最大（0.8249），2016 年和2018 年群體遺傳相似系數最小（0.4505）。遺傳距離為0.1925～0.7974，其中2016 年和2018 年群體遺傳距離最大（0.7974），2015 年和2017 年群體遺傳距離最小（0.1925）。

3 討論

3.1 圖們江大麻哈魚生殖洄游群體遺傳多樣性

本研究利用10 對已發表的高度多態微衛星位點（PIC＞0.5）分析了圖們江4 個年度大麻哈魚群體的遺傳結構及多樣性。這些位點遺傳多樣性較豐富，適宜用于大麻哈魚群體的遺傳多樣性評估[26]。

表4 大麻哈魚4 個群體Nei 氏遺傳相似系數（上三角）及遺傳距離（下三角）Tab.4 Nei’s genetic identity（diagonal above）and genetic distance（diagonal below）in four groups of chum salmon

遺傳多樣性是種內個體之間或一個群體內不同個體的遺傳變異總和，是一個物種成功應對人為干擾的決定因素。遺傳多樣性程度決定著其進化趨勢[27]。本研究利用10 對微衛星標記分析了圖們江大麻哈魚4 個年度生殖洄游群體的遺傳多樣性，主要分析了等位基因數、有效等位基因數、雜合度、多態信息含量、香農指數和Hardy-Weinberg 平衡檢驗等。結果表明，4 個群體平均等位基因數：9.7～10.6；平均有效等位基因數：4.7853～6.1309；平均觀測雜合度為0.6500～0.7200，平均期望雜合度為0.7663～0.8359。雜合度是指隨機抽取的樣本中兩個等位基因不相同的可能性。期望雜合度主要是根據種群內當前優勢等位基因的分布頻率來推算的。而觀測雜合度是隨機抽取的兩個樣本的等位基因不相同的概率。雜合度越高說明遺傳多樣性越豐富[28]。雖然圖們江大麻哈魚人工增殖放流活動已開展十余年，但其群體遺傳多樣性仍較豐富，平均期望雜合度甚至略高于Chen 等[29]2005 年對圖們江流域大麻哈魚群體的評估結果。

平均多態信息含量（PIC）表示一個后代所獲得某個等位標記來自其親本的同一個等位標記的可能性，分為低度（＜0.25）、中度（介于0.25～0.5 之間）和高度多態位點（＞0.5）[30]，通常用來評估遺傳多樣性豐度。據此，本研究中10 個微衛星分析4 個圖們江大麻哈魚群體的平均多態信息含量為0.7288～0.8017，均大于0.5，屬于高度多態性群體。

Hardy-Weinberg 平衡條件是：無限大的群體；隨機婚配；沒有突變；沒有選擇；沒有遷移；沒有遺傳漂變（小群體內基因頻率隨機波動）[31]。但實際應用中，一般沒有完全符合理想情況的群體。用P 值衡量群體的基因型分布與H-W 平衡偏差的程度，P值越低表示偏差越大。本研究中可能樣本量不足、分型有誤或樣本選取偏差，40 個多態位點中僅29個符合H-W 平衡[32]。

3.2 圖們江大麻哈魚生殖洄游群體間遺傳結構

基因流（Nm）和群體間遺傳分化系數（Fst）是用來分析群體間遺傳分化程度的兩個重要參數。Slatkin[33]和Hamrick[34]認為，Nm 越小群體分化程度越大。本研究中10 個位點的平均Nm 值為3.0598，介于1～4 之間，表明群體間發生了一般程度的基因交流。

通常用Fst（Fixation index）來衡量群體之間的遺傳分化。Fst 為1 說明兩個群體完全獨立；0 說明兩個群體之間自由雜交。Fst 值越大，說明遺傳距離越遠；值越低，說明大多數的遺傳變異發生在同一個群體內。Wright[35]建議，實際研究中，Fst 小于0.05，可以忽略不計；Fst 介于0.05～0.15 之間，表明遺傳分化程度中等；Fst 高于0.15 則遺傳分化程度較大。本實驗Fst 為0.0755，說明約有92.45%的遺傳變異存在于種群內，7.55%的遺傳變異存在于種群間，屬中等程度的遺傳分化。群體內近交系數為正值，表明群體內近交明顯。

遺傳相似性和遺傳距離能夠衡量出群體間的遺傳關系[36]。本研究中，2015 年和2017 年群體遺傳相似系數最大（0.8249），遺傳距離最小（0.1925），親緣關系最近。相反，2016 年和2018 年群體遺傳相似系數最?。?.4505）。遺傳距離最大（0.7974），親緣關系最遠。

為補充大麻哈魚種質資源量，每年都開展大麻哈魚人工增殖放流活動，但由于放流群體和自然群體之間存在遺傳差異，勢必會對自然種群產生負面影響[37]，必須建立科學合理的人工增殖放流體系，檢測人工增殖親本的遺傳多樣性和遺傳結構，這對保障人工增殖放流效果具有重要意義。本研究表明：中國圖們江大麻哈魚生殖群體遺傳多樣性較高，具有一定的遺傳潛力，可作為選育群體。建議不同增殖群體可在不同流域交叉放流，使群體遺傳多樣性更加豐富，最大限度減少人工增殖放流對野生群體遺傳結構及多樣性的影響[38]。